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背景：
結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。闡明CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制將有助于尋找新的診斷生物標(biāo)志物和開(kāi)發(fā)有效的治療干預(yù)措施。在過(guò)去的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與結(jié)直腸癌形成和發(fā)展的蛋白質(zhì)編碼基因，本研究主要針對(duì)microRNA（miRNA）在CRC中的作用進(jìn)行探討。

內(nèi)容概述：
2019年2月，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在期刊Nature Communications上發(fā)表題為“The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer”的文章，發(fā)現(xiàn)CRC組織中miR-500a-5p的低表達(dá)與CRC惡性發(fā)展相關(guān)。在CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-500a-5p可使其G0/G1期阻滯，抑制其生長(zhǎng)和遷移。從機(jī)制上講，miR-500a-5p直接結(jié)合HDAC2基因并抑制其介導(dǎo)的裸鼠大腸癌細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子YY1與miR-500a-5p的啟動(dòng)子結(jié)合并負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，且miR-500a-5p的水平還受到p300/YY1/HDAC2復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控。小鼠模型實(shí)驗(yàn)也表明miR-500a-5p表達(dá)可顯著抑制腫瘤的發(fā)展。該研究為結(jié)直腸癌治療提供了新的潛在候選基因。

主要技術(shù)：
Co-IP、ChIP、蛋白質(zhì)譜檢測(cè)（LC-MS/MS）、雙熒光素酶分析等；
輝駿生物為本研究提供了蛋白質(zhì)譜檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究路線(xiàn)：

 
研究結(jié)果：
1. miR-500a-5p在CRC中低表達(dá)，與 CRC的惡性發(fā)展有關(guān)
研究者通過(guò)miRNA微陣列分析確定了人正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和LoVo中的miRNA表達(dá)譜，其中17個(gè)miRNA在2種CRC細(xì)胞中有相似的表達(dá)模式（圖1a），并從中選擇了miR-500a-5p做進(jìn)一步研究。qPCR檢測(cè)確認(rèn)miR-500a-5p在CRC細(xì)胞系及人類(lèi)CRC組織中低表達(dá)（圖1b-d）。原位雜交（ISH）顯示miR-500a-5p定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（圖1e）。此外，研究者將患者按照低表達(dá)/高表達(dá)分組，Kaplan–Meier生存曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，miR-500a-5p表達(dá)低的結(jié)腸癌患者的總體生存期較短。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-500a5p在CRC細(xì)胞中的低表達(dá)與CRC患者的低生存率有關(guān)。

CRC的臨床病理特征分析結(jié)果表明miR-500a-5p的低表達(dá)與CRC的惡性進(jìn)展有關(guān)。為探討miR-500a-5p的作用，分別在低表達(dá)miR-500a-5p的CRC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p模擬物，在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p抑制劑?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-500a-5p水平升高導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，水平降低導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快（圖1f-i）。FACS分析、傷口愈合、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明，miR-500a-5p對(duì)CRC細(xì)胞的惡性特征有抑制作用。

2. HDAC2是miR-500a-5p的靶標(biāo)
采用4個(gè)公共的miRNA預(yù)測(cè)工具(miRanda, TargetScan, miRTP 和RNA22-HSA)，并結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)(圖2a)，預(yù)測(cè)miR-500a-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)HDAC2可能是其潛在靶標(biāo) (圖2b)。首先，WB和qPCR檢測(cè)潛在靶基因HDAC2與miR-500a-5p水平是否有相關(guān)性，結(jié)果顯示10對(duì)癌組織和正常組織樣本中的HDAC2蛋白水平較高，而miR-500a-5p水平較低(圖2c，d)；81例CRC患者組織中HDAC2的mRNA水平與miR-500a-5p水平呈負(fù)相關(guān)(圖2e)。之后，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)確定HDAC2是否為miR-500a-5p的直接靶標(biāo)，結(jié)果顯示，miR-500a-5p模擬物與HDAC2-3? UTR共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光素酶活性降低，而當(dāng)突變了3’UTR上的2個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)中的任意一個(gè)后，miR-500a-5p都不能再抑制熒光素酶活性(圖3a，b)，進(jìn)一步證實(shí)了HDAC2是miR-500a-5p的靶基因。當(dāng)在CRC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p 模擬物后，HDAC2蛋白表達(dá)下調(diào)，在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p抑制劑后，HDAC2蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3c)。克隆形成、WST-1和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，HDAC2的過(guò)表達(dá)可以部分消除miR-500a-5p對(duì)細(xì)胞惡性特征的抑制作用(圖3d-f)。綜上所述，miR-500a-5p通過(guò)抑制HDAC2的表達(dá)來(lái)阻礙CRC發(fā)生和發(fā)展。
 

3. miR-500a-5p通過(guò)靶向HDAC2在體內(nèi)抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)
接下來(lái)，研究者分別將表達(dá)miR-500a-5p、m-NC、HDAC2、空載體，和同時(shí)表達(dá)miR-500a-5p/HDAC2的LoVo細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，建立了5種小鼠異種移植模型，評(píng)估m(xù)iR-500a-5p對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 (圖4a)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-500a-5p組的腫瘤最小，HDAC2組的腫瘤最大，miR-500a-5p/HDAC2組的腫瘤小于HDAC2組 (圖4a，b)；之后他們又檢測(cè)了五組移植瘤中細(xì)胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)。IHC染色結(jié)果顯示，miR-500a-5p組的增殖率和腫瘤血管密度最低，HDAC2組最高， miR-500a-5p和HDAC2的過(guò)表達(dá)部分削弱了HDAC2對(duì)生長(zhǎng)速度和腫瘤血管密度的作用(圖4c- f)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)miR-500a-5p抑制了HDAC2介導(dǎo)的小鼠CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。
 

4. miR-500a-5p受轉(zhuǎn)錄因子YY1負(fù)調(diào)控
為了確定miR-500a-5p受哪些因素調(diào)控，研究者分析了其基因上游1kb的基因組DNA序列。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，該序列中含有miR-500a-5p啟動(dòng)子。以往報(bào)道證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子YY1與HDAC相互作用，因此作者研究了轉(zhuǎn)錄因子YY1能否調(diào)控CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的表達(dá)。CONSITE軟件分析顯示YY1在miR-500a-5p啟動(dòng)子上有3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（?327~?333，?622~?628和?741~?747） (圖5a，b)。接著，將這三個(gè)位點(diǎn)序列分別構(gòu)建熒光素酶載體，使之與YY1載體或空載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，結(jié)果表明，YY1的加入使這3個(gè)位點(diǎn)序列的啟動(dòng)子活性均降低了2.5倍以上(圖5c)。為了證實(shí)YY1能夠在體內(nèi)與miR-500a-5p啟動(dòng)子結(jié)合，作者在過(guò)表達(dá)YY1的CRC細(xì)胞中用YY1抗體進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測(cè)，確定miR-500a-5p啟動(dòng)子區(qū)域的這3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)均有顯著富集(圖5d)。

接下來(lái)，他們分析了YY1和miR-500a-5p在CRC組織中的表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌組織中有更高水平的YY1（蛋白和RNA）和更低水平的miR-500a-5p (圖5e，f)。此外，CRC細(xì)胞中YY1的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致miR-500a-5p成熟體、前體和初始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄都減少了(圖5g)。研究者還評(píng)估了HDAC2或YY1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，HDAC2和YY1的表達(dá)與CRC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。最后，采用免疫組織化學(xué)(IHC)或原位雜交(ISH)方法檢測(cè)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-500a-5p在CRC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，HDAC2和YY1的表達(dá)明顯高于癌旁組織。miR-500a-5p的表達(dá)與HDAC2或YY1呈負(fù)相關(guān)（圖5h）。這些結(jié)果表明，YY1下調(diào)了CRC細(xì)胞miR-500a-5p的水平，進(jìn)而影響HDAC2水平。  
 

5. YY1/p300/HDAC2復(fù)合體調(diào)控了CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的水平
由于組蛋白乙?；绞艿浇M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP/p300, HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)的共同調(diào)控。以往報(bào)道指出，HDAC2和p300均可與YY1相互作用，因此研究者進(jìn)一步探討了HDAC2-p300，HDAC2-p300-YY1的作用關(guān)系。過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性P300蛋白的Co-IP實(shí)驗(yàn)均顯示P300可以與HDAC2和YY1相互作用(圖6a，c)，過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性HDAC2蛋白的Co-IP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果(圖6b，d)，表明HDAC2-p300-YY1可能以復(fù)合物形式存在。

為了探討miR-500a-5p與YY1/p300/HDAC2復(fù)合體的關(guān)系，設(shè)置如下組別：YY1、HDAC2、p300、YY1+p300、HDAC2+p300、YY1+HDAC2+p300；轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)miR-500a-5p水平，發(fā)現(xiàn)p300可促進(jìn)miR-500a-5p轉(zhuǎn)錄，YY1或HDAC2抑制其轉(zhuǎn)錄，p300與HDAC2和/或YY1的組合也抑制其轉(zhuǎn)錄(圖6e)，表明YY1或HDAC2對(duì)p300有拮抗作用。之后以上7組載體分別與miR-500a-5p啟動(dòng)子的熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)miR-500a-5p啟動(dòng)的雙熒光素酶活性，進(jìn)一步確定了p30的促進(jìn)作用，及其YY1或HDAC2的抑制作用(圖6f)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)YY1和miR-500a-5p啟動(dòng)子三個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合程度受YY1自身水平，以及HDAC2和p300水平影響。YY1、HDAC2的過(guò)表達(dá)增加了YY1與miR-500a-5p啟動(dòng)子3個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合，而p300的過(guò)表達(dá)減少了YY1與這3個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合(圖6g)；當(dāng)干擾YY1、HDAC2和p300時(shí)，結(jié)果剛好相反(圖6h)。此外，p300的過(guò)表達(dá)則削弱了HDAC2與3個(gè)YY1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。這些結(jié)果表明，YY1/p300/HDAC2復(fù)合體調(diào)控了CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的水平。
 

6. miR-500a-5p能夠抑制異種移植瘤和FK228治療的CRC腫瘤發(fā)展
為了研究miR-500a-5p在結(jié)直腸癌中的作用分子機(jī)制，研究者檢測(cè)了miR-500a-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，確定miR-500a-5P能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。當(dāng)miR-500a-5p與HDAC抑制劑FK228共同作用時(shí)，細(xì)胞凋亡率要顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-500a-5p的組別(圖7a)。這些結(jié)果表明miR-500a-5p可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)FK228誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。為了探討miR-500a-5p對(duì)CRC的治療潛力，研究者建立了異種移植小鼠模型和FK228處理的CRC模型。結(jié)果顯示，移植LoVo細(xì)胞39天后，miR-500a-5p和miR-500a-5p+FK228組小鼠的腫瘤體積明顯小于m-NC組（圖7c，d）。TUNEL染色顯示，miR-500a -5P+FK228組的腫瘤細(xì)胞凋亡率最高(圖7e)。這些發(fā)現(xiàn)提示miR-500a-5p增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)HDAC抑制劑FK228誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。以上結(jié)果表明，miR-500a-5p具有腫瘤抑制作用，具有治療CRC的潛力。

結(jié)論：
本研究確定miR-500a-5p在結(jié)直腸癌組織中下調(diào)，miR-500a-5p水平受到Y(jié)Y1/p300/HDAC2轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控。此外，miR-500a-5p還通過(guò)直接結(jié)合HDAC2的3’UTR來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。