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背景：
轉(zhuǎn)移性前列腺癌具有很高的致命性。已有報(bào)道表明，膽固醇與前列腺癌的發(fā)展有關(guān)，但對(duì)前列腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用及潛在機(jī)制尚不清楚。了解膽固醇在前列腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及具體機(jī)制，才能為前列腺癌的治療提供新的策略。

內(nèi)容概述：
2019年4月，中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所生物醫(yī)學(xué)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在期刊Cancer Research（IF₂₀₁₉=9.727）上發(fā)表題為“Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP”的最新論文。在這項(xiàng)研究中，研究者首次發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白APMAP在前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。APMAP通過減少EGFR的內(nèi)吞作用參與膽固醇誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞EMT。該發(fā)現(xiàn)可能為前列腺癌的診斷和治療提供新希望。
 
主要技術(shù)：
RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)、Co-IP、LC-MS/MS、細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)等；
輝駿生物為本研究提供了Co-IP和LC-MS/MS檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究路線：

 
研究結(jié)果：
1. 膽固醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生依賴于ERK1/2的激活
研究者首先探索了膽固醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞EMT、細(xì)胞遷移和侵襲的作用。采用膽固醇處理前列腺癌細(xì)胞后，作者發(fā)現(xiàn)EMT標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)升高了，E-cadherin表達(dá)降低了，說明膽固醇會(huì)影響前列腺癌細(xì)胞的EMT；傷口愈合實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明膽固醇處理增加了細(xì)胞的遷移和侵襲（圖1C-D）。降血脂藥物辛伐他汀的處理逆轉(zhuǎn)了上述作用。
另外，通過對(duì)ERK1/2, AKT, TGFb和Wnt等幾種調(diào)控EMT的信號(hào)通路的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：膽固醇處理可以使ERK1/2的磷酸化增加。后續(xù)的ERK1/2抑制劑實(shí)驗(yàn)也顯示，膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲在兩種ERK抑制劑治療后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這表明ERK信號(hào)通路在膽固醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT的過程中至關(guān)重要（圖1E-H）。

 
2. 膽固醇促進(jìn)EGFR和APMAP在脂筏中積累
為了全面了解膽固醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響，研究者對(duì)膽固醇處理的PC-3細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq實(shí)驗(yàn)，并對(duì)差異基因做了生物信息學(xué)分析，其中KEGG pathway分析結(jié)果顯示，差異基因主要富集在EGFR、WNT和VEGF信號(hào)通路中，而這些通路都參與了EMT（圖2A）。此外，GO富集分析表明膽固醇可能參與了膜筏相關(guān)的過程，如膜筏極化、定位和分布等（圖2B，C）。對(duì)前列腺癌細(xì)胞的免疫組化實(shí)驗(yàn)也表明膽固醇處理顯著增加了細(xì)胞表面脂筏的形成（圖2D）。
為了探索哪些蛋白質(zhì)參與了EMT過程，作者又采用標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)分析了膽固醇處理前后的PC-3細(xì)胞脂筏中的蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)ERK1/2的上游調(diào)節(jié)因子EGFR以及和結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的APMAP蛋白在膽固醇處理后的脂筏中均有增加，western-blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果(圖2E)。為進(jìn)一步確定APMAP是否參與EGFR的積累，將EGFR-RFP載體轉(zhuǎn)染至APMAP缺失的PC-3細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，再用膽固醇處理。在對(duì)照細(xì)胞中，膽固醇處理增強(qiáng)了EGFR-RFP的熒光，而當(dāng)APMAP被敲除后，膽固醇對(duì)EGFR的影響幾乎完全被抑制(圖2F)。同時(shí)，APMAP的敲除削弱了EGFR的積累，從而降低了膽固醇誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化(圖2G)。這些數(shù)據(jù)表明，APMAP增加了前列腺癌細(xì)胞中由膽固醇誘導(dǎo)的EGFR的蛋白水平。

 
3. APMAP通過EGFR促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT
接下來，研究者對(duì)APMAP基因敲除后的PC-3細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq實(shí)驗(yàn)，對(duì)差異表達(dá)基因的功能分析顯示：它們富集在MAPK、Notch、粘附相關(guān)信號(hào)通路以及類固醇生物合成和膽固醇代謝過程中(圖3A)，表明APMAP和膽固醇可能有重疊的功能。APMAP敲除顯著抑制了膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲能力和EMT過程(圖3B-D)。相反，APMAP的過表達(dá)促進(jìn)了遷移和侵襲，而EGFR抑制劑則抑制了這一效應(yīng)(圖3E，F(xiàn))。此外，EGFR抑制劑顯著抑制了ERK1/2的激活，并抑制了APMAP過表達(dá)細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)(圖3G)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之類似，與對(duì)照組相比，注射膽固醇組的細(xì)胞明顯形成更多的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。膽固醇組的轉(zhuǎn)移瘤組織中，EGFR mRNA、APMAP和Vimentin的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，APMAP基因敲除顯著降低了它們的表達(dá)水平(圖3J，K)。這些數(shù)據(jù)表明APMAP通過調(diào)節(jié)EGFR參與膽固醇誘導(dǎo)的EMT過程。

4. 膽固醇通過APMAP降低EGFR的內(nèi)吞
為了更好的確定膽固醇如何促進(jìn)脂筏中EGFR的積累，作者采用qRT-PCR技術(shù)分析了膽固醇對(duì)EGFR轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)并無影響(圖4A)，這說明APMAP對(duì)EGFR水平的調(diào)節(jié)發(fā)生在翻譯后。之后又用溶酶體抑制劑“氯喹”和/或膽固醇處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)不加氯喹時(shí)，膽固醇可以增加EGFR的水平，加入氯喹時(shí)，膽固醇的加入與否并不影響EGFR蛋白水平 (圖4B)，說明膽固醇對(duì)EGFR的作用與氯喹相同，即抑制EGFR的降解。他們接著在膽固醇處理48h后，又采用蛋白質(zhì)翻譯抑制劑“環(huán)己酰亞胺”在不同時(shí)間處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在APMAP敲除細(xì)胞中，膽固醇處理使EGFR的水平顯著降低了(圖4C)。
眾所周知EGFR的降解依賴于其內(nèi)吞，研究者推測(cè)膽固醇對(duì)EGFR降解的抑制是通過EGFR的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)的。間接免疫熒光結(jié)果顯示，膽固醇處理降低了EGFR和早期內(nèi)體標(biāo)志物Rab5在兩個(gè)細(xì)胞中的共定位（圖4D，E）；APMAP-GFP與Rab5-RFP的共定位增加(圖4F)。接下來，作者探討了APMAP是否抑制EGFR的內(nèi)吞。轉(zhuǎn)染EGFR-GFP/Rab5-RFP和APMAP-GFP/Rab5-RFP至PC-3細(xì)胞，膽固醇處理后，APMAP沉默的細(xì)胞中EGFR與Rab5的共定位增加(圖4G)。這些數(shù)據(jù)表明，APMAP調(diào)節(jié)膽固醇介導(dǎo)的EGFR穩(wěn)定性。
 

5. APMAP通過與EPS15R相互作用抑制EGFR內(nèi)吞
研究者又使用Co-IP和LC/MS-MS技術(shù)篩選了APMAP的結(jié)合蛋白，并對(duì)它們做了GO和pathway富集分析，數(shù)據(jù)表明APMAP參與了囊泡運(yùn)輸。由于EPS15R參與EGFR的內(nèi)吞，研究者首先通過Co-IP證實(shí)了內(nèi)源性APMAP與EPS15R的相互作用(圖5C)，并且發(fā)現(xiàn)EPS15R的蛋白水平不受膽固醇的影響(圖5D)，質(zhì)膜免疫熒光顯示，因膽固醇的加入，EPS15R與APMAP的相互作用增強(qiáng)(圖5F)，并與EGFR解離(圖5G)。根據(jù)這些結(jié)果，研究者推測(cè)EPS15R在APMAP介導(dǎo)的EGFR降解中起關(guān)鍵作用。為驗(yàn)證假設(shè)，他們?cè)谀懝檀继幚淼腄U145細(xì)胞中進(jìn)行了APMAP沉默和/或EPS15R沉默，免疫熒光顯示，APMAP沉默促進(jìn)EGFR向早期內(nèi)體募集的作用被EPS15R的沉默所阻斷(圖5H)。在有膽固醇存在的APMAP沉默細(xì)胞中，EGFR的蛋白水平因EPS15R的沉默而恢復(fù)(圖5I)。這些結(jié)果表明，APMAP通過與EGFR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EPS15R，抑制EGFR內(nèi)吞到早期內(nèi)體，從而影響膽固醇誘導(dǎo)的EGFR蛋白的穩(wěn)定性。

 
6. APMAP在前列腺癌中顯著上調(diào)
為了了解APMAP在惡性腫瘤中的作用，研究者對(duì)15種癌癥中APMAP的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中APMAP的表達(dá)均顯著高于鄰近正常組織(圖6B)。ROC曲線分析顯示APMAP表達(dá)在預(yù)測(cè)前列腺癌組織與正常組織的敏感性和特異性(圖6C)。為探討APMAP在前列腺癌組織和正常組織中的表達(dá)情況，對(duì)80例前列腺癌患者和8例正常對(duì)照的組織芯片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示與正常組織相比，前列腺癌組織中APMAP蛋白的表達(dá)增加(圖6D)。APMAP在腫瘤中的表達(dá)明顯增高,說明APMAP可作為前列腺癌的潛在診斷標(biāo)記物。

結(jié)論：
先前的研究發(fā)現(xiàn)膽固醇會(huì)增加侵襲性前列腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，本項(xiàng)目研究進(jìn)一步證明膽固介導(dǎo)APMAP上調(diào)，進(jìn)而抑制EGFR降解，激活ERK1/2通路，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT；提出APMAP可能是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)劑，為高脂肪飲食、肥胖和癌癥轉(zhuǎn)移之間提供了聯(lián)系。