用于hPSC基因編輯的新方法產(chǎn)生高達84%的敲除效率

發(fā)布時間：2022-09-13 14:30:27作者：輝駿生物-fitgene

賓夕法尼亞州立大學領(lǐng)導的跨學科研究團隊開發(fā)了提高 CRISPR-Cas9 效率的技術(shù)，該基因組編輯技術(shù)在 2020 年獲得了諾貝爾獎。雖然 CRISPR-Cas9 比其他基因編輯更快、更便宜、更準確方法，根據(jù)賓夕法尼亞州立大學生物醫(yī)學工程和生物學副教授、項目負責人Lian 的說法，該技術(shù)有局限性，特別是在改善人類健康的應用中。

研究人員開發(fā)了一種更有效、更容易獲得的方法，將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應用于人類多能干細胞 (hPSC)，該系統(tǒng)來源于聯(lián)邦政府批準的干細胞系，Lian 表示，這可以極大地推進遺傳疾病的診斷和治療。該方法于 9 月 7 日發(fā)表在《Cell Reports Methods》上。

CRISPR-Cas9 代表成簇的定期間隔短回文重復和 CRISPR 相關(guān)蛋白 9，使科學家能夠靶向遺傳密碼的精確位置以改變 DNA，從而提供創(chuàng)造新診斷工具和可能糾正突變以治療遺傳原因的機會的疾病。

CRISPR 使用稱為質(zhì)粒 DNA 的遺傳物質(zhì)盤來傳遞引導的核糖核酸 (RNA)，將 Cas9 酶定位在目標基因的精確位置。當 DNA 被定位時，Cas9 與其結(jié)合并將其切斷，從而允許其他 DNA 修復切割。然后研究人員可以看到去除如何改變基因的表達。但 Lian 表示，目前基于 DNA 的 CRISPR 方法存在交付和編輯效率問題。

DNA CRISPR 效應器的交付率很低，當使用 CRISPR 時，只有 20% 到 30% 的目標細胞會接受基因編輯 DNA。將 RNA 遞送到細胞中可以更有效；但是，當引入常規(guī) RNA 時，細胞可以將其視為病毒。它們會破壞RNA 在它可以制造蛋白質(zhì)之前，比如說，在幾個小時內(nèi) - 并且這樣做會破壞基因編輯的嘗試。

為了改善結(jié)果，研究人員使用修飾的 RNA (modRNA) 改變了將基因組編輯工具傳遞給干細胞的方式。 modRNA 與質(zhì)粒 DNA 的不同之處在于它用化學修飾的形式取代了 RNA 中發(fā)現(xiàn)的一種基礎(chǔ)底物，并且通過更強的結(jié)構(gòu)支持來穩(wěn)定它。

發(fā)現(xiàn) modRNA 比質(zhì)粒 DNA 更有效，大約 90% 的細胞通過簡單的轉(zhuǎn)染獲得了 modRNA，因此它能夠保持原位并完成其工作。研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA 存在的時間是理想的：足夠長以修飾細胞，但又不會太長以至于導致脫靶活動。但據(jù) Lian 說，modRNA 引入了另一個問題。

當 modRNA Cas9 成功傳遞到目標基因時，它會在基因組中產(chǎn)生雙鏈斷裂，一些細胞會嘗試修復它。那些自我修復的人可以將修復或“突變”傳遞給他們的后代。這是研究人員想要更好地理解的過程，因此這些是他們想要收獲和研究的細胞。 Lian 說，問題在于大多數(shù)有這種斷裂的細胞將其視為基因組的一個主要問題，并且會自我毀滅而不是試圖自我修復。

為了減少 Cas9 的毒副作用并幫助編輯后的細胞存活，Lian 的團隊引入了一種已知有助于細胞生長的小蛋白質(zhì)。據(jù) Lian 介紹，這種添加的蛋白質(zhì)抑制了細胞死亡，并將 Cas9 編輯效率提高了 84%。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA 可以改進其他基因編輯技術(shù)，例如堿基編輯。堿基編輯可以通過使用蛋白質(zhì)改變單個核苷酸而不是像 CRISPR 那樣切割兩條鏈來敲除基因或糾正基因組中的突變。

“我們用基于質(zhì)?；蚧?modRNA 的堿基編輯蛋白轉(zhuǎn)染干細胞，”Lian 說。 “我們基于 modRNA 的方法在成功編輯基因組方面的效率是基于質(zhì)粒的技術(shù)（大約 16%）的四倍多，達到 68%?！?

Lian 表示，隨著更多基因編輯實驗室提高基因編輯效率和有效性，研究人員將能夠更快地更好地了解基因及其功能。人體有 20,000 多個基因，但我們只研究了其中約 10% 的功能，一次一個地檢查每個剩余基因的目的可能需要一生的時間。使用來自我們高效基因編輯技術(shù)的工程干細胞可以大大加快這一過程。

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