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轉(zhuǎn)錄組測序 對研究人員很重要，因為它們幫助我們了解細(xì)胞機器如何解釋基因組序列以及這些序列的改變。 它們對于許多功能分析也是必要的。 如果沒有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄組注釋，就不可能進(jìn)行 RNA-seq 研究來探索差異基因表達(dá)或預(yù)測組織或生物體中存在哪些蛋白質(zhì)。

現(xiàn)在測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到可以很快以比以前更低的成本為更廣泛的生物（包括單細(xì)胞真核生物）生成高質(zhì)量的基因組參考和轉(zhuǎn)錄組注釋的地步。雖然基因組將很快組裝成具有合理可靠性的染色體規(guī)模支架，但技術(shù)限制阻止轉(zhuǎn)錄組注釋技術(shù)識別從這些染色體表達(dá)的基因和同種型。

現(xiàn)在可以使用短讀長測序、鏈接短讀長測序、長讀長測序和光學(xué)作圖等技術(shù)的組合來構(gòu)建高質(zhì)量的“著絲粒到端?！被蚪M序列?；蚪M組裝現(xiàn)在正進(jìn)入黃金時代。從單細(xì)胞真核生物到北極熊的非模式生物將從這些強大且相對便宜的方法中受益匪淺，而這些方法以前缺乏以艱難的方式生成高質(zhì)量基因組參考所需的注意力和大筆資金——染色體圖譜、桑格測序細(xì)菌人工染色體文庫等。

大多數(shù)基因組組裝突破不適用于轉(zhuǎn)錄組注釋。短讀長和長讀長測序技術(shù)現(xiàn)在用于轉(zhuǎn)錄組注釋，但是，它們都存在缺陷，使得實現(xiàn)“參考級”轉(zhuǎn)錄組注釋既耗時又困難。

異構(gòu)體的全長轉(zhuǎn)錄組測序工作流程

300 ng 總 RNA 用于異構(gòu)體測序。選擇 poly-A RNA 后，將其轉(zhuǎn)化為 cDNA，為文庫組裝做準(zhǔn)備。此外，最多可對 12 個樣品進(jìn)行多重分析，以實現(xiàn)一種簡化且經(jīng)濟高效的方法。

獲得測序數(shù)據(jù)后，選擇兩側(cè)有 cDNA 引物和 poly-A 尾的讀數(shù)作為全長讀數(shù)。然后可以按轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體對讀數(shù)進(jìn)行分組，以產(chǎn)生獨特的共識。

然后可以將異構(gòu)體映射到參考基因組，并且可以使用 SQANTI 和 Maker 等工具以基于參考的方式注釋異構(gòu)體。PacBio 的 Iso-Seq 分析采用一鍵式生物信息學(xué)程序來處理同種型數(shù)據(jù)，而無需參考基因組或從頭方法注釋。

全長轉(zhuǎn)錄本測序的應(yīng)用

基因組注釋是的首次應(yīng)用全長轉(zhuǎn)錄序列。這在植物和動物科學(xué)中特別有用，其中基因組通常比人類基因組復(fù)雜得多，并且參考質(zhì)量的基因組組裝可能仍然非常昂貴。

全長轉(zhuǎn)錄本還有助于表征以前由于片段重復(fù)而難以識別的人類基因。研究人員觀察了在大腦中表達(dá)的具有長片段重復(fù)的 19 個基因家族，發(fā)現(xiàn)由于新的轉(zhuǎn)錄起始、剪接和聚腺苷酸化位點，近一半的表達(dá)基因重復(fù)與其祖先模型發(fā)生了顯著變化。

其他人已經(jīng)采用全長 RNA 測序以類似的方式分析可變剪接和多聚腺苷酸化譜，但這次是在物種之間。