穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建是將外源DNA通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因穩(wěn)定表達(dá)或干擾的技術(shù)。由于慢病毒可將外源片段穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組，因此特別適合用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建。慢病毒感染比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更容易操作，并且對(duì)各類細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都很高，篩選周期短。

轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞選用與載體抗性標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的藥物進(jìn)行細(xì)胞篩選，從而得到可穩(wěn)定表達(dá)/沉默目的基因的細(xì)胞株。最常用的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin) 。

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程

穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程.jpg

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)信息

輝駿生物提供的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)主要分為以下兩種：

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)
服務(wù)項(xiàng)目	服務(wù)內(nèi)容	結(jié)果交付	實(shí)驗(yàn)周期	客戶提供
表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建	構(gòu)建基因表達(dá)慢病毒載體	載體質(zhì)粒、甘油菌、測(cè)序結(jié)果和報(bào)告	2-3周	1.細(xì)胞及其培養(yǎng)方法 2. 實(shí)驗(yàn)信息表（相關(guān)基因信息、載體要求等）
	包裝基因表達(dá)慢病毒	篩選好的表達(dá)細(xì)胞株、對(duì)照細(xì)胞株和報(bào)告	9-10周
	感染并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株	篩選好的表達(dá)細(xì)胞株、對(duì)照細(xì)胞株和報(bào)告
	qPCR檢測(cè)表達(dá)效率	檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告
shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建	針對(duì)基因序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建3個(gè)shRNA慢病毒載體	載體質(zhì)粒、甘油菌、測(cè)序結(jié)果和報(bào)告	2-3周	1.細(xì)胞及其培養(yǎng)方法 2. 實(shí)驗(yàn)信息表（相關(guān)基因信息、載體要求等）
	shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行干擾效率檢測(cè)	干擾效率檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告	2周
	干擾效率最高的shRNA質(zhì)粒包裝慢病毒	篩選好的shRNA細(xì)胞株、對(duì)照細(xì)胞株和報(bào)告	9-10周
	感染并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株	篩選好的shRNA細(xì)胞株、對(duì)照細(xì)胞株和報(bào)告
	qPCR檢測(cè)表達(dá)效率	檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告

添加技術(shù)員微信溝通實(shí)驗(yàn)

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**穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)服務(wù)*輝駿優(yōu)勢(shì)**

① 近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，眾多服務(wù)案例，服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可

② 自有分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線

③ 售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例

穩(wěn)定細(xì)胞系熒光檢測(cè)圖

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建-客戶文章

Yang T. et al: CD151 promotes Colorectal Cancer progression by a crosstalk involving CEACAM6, LGR5 and Wnt signaling via TGFβ1. Int J Biol Sci. 2021, IF 6.58.

【研究?jī)?nèi)容】：研發(fā)發(fā)現(xiàn)CD151在結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)組織中表達(dá)較高，能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。RNA-seq和CoIP-MS實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)和篩選了受CD151表達(dá)影響且與CD151相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)蛋白——TGFβ1，CEACAM6和LGR5。pull down和免疫熒光實(shí)驗(yàn)確定了它們間的相互作用。基因沉默和回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，CD151可能通過TGFβ1來促進(jìn)CEACAM6、LGR5和Wnt通路。

使用技術(shù)：shRNA慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

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Wu M.H. et al: MafF Is Regulated via the circ-ITCH/miR-224-5p Axis and Acts as a Tumor Suppressor in Hepatocellular Carcinoma. Oncol Res. 2020, IF=5.574.

【研究?jī)?nèi)容】：本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織和細(xì)胞中MafF（一種轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)較低。慢病毒介導(dǎo)的MafF過表達(dá)抑制HCC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。生物信息學(xué)分析和熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定了MafF是miR-224-5p的直接靶點(diǎn)。RNA pull down實(shí)驗(yàn)表明，circ-ITCH可作為miR-224-5p海綿發(fā)揮作用?；虮磉_(dá)/回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明，MafF的表達(dá)和抗腫瘤作用可通過circ-ITCH/miR-224-5p軸調(diào)節(jié)。本研究證實(shí)了MafF在HCC中的抑癌作用，揭示了MafF的上游調(diào)控機(jī)制，為HCC的潛在治療靶點(diǎn)提供了新的視角。

使用技術(shù)：過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒包裝、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

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Ma H.H. et al: Pharmacological Properties of the Type 1 Tyramine Receptor in the Diamondback Moth, Plutella xylostella. Int J Mol Sci. 2019, IF=5.923.

【研究?jī)?nèi)容】：酪胺受體（TAR）可被酪胺（TA）或章魚胺（OA）激活，并已被證明與多種昆蟲的生理調(diào)節(jié)（如味覺反應(yīng)、社會(huì)組織和學(xué)習(xí)行為）有關(guān)。作者在小菜蛾中新克隆得到一個(gè)酪胺受體基因Pxtar1，并在293T細(xì)胞中利用慢病毒進(jìn)行了該基因的穩(wěn)定表達(dá)，功能實(shí)驗(yàn)也顯示酪胺可以激活PxTAR1受體，此外，作者還調(diào)查了Pxtar1在小菜蛾體內(nèi)的表達(dá)模式。

使用技術(shù)：過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建檢測(cè)、慢病毒包裝技術(shù)服務(wù)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)

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He S.L. et al: FAM3B promotes progression of oesophageal carcinoma via regulating the AKT–MDM2–p53 signalling axis and the epithelial‐mesenchymal transition. J Cell Mol Med. 2019, IF=5.31.

【研究?jī)?nèi)容】：本研究發(fā)現(xiàn)FAM3B在人食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后有相關(guān)性。慢病毒介導(dǎo)的FAM3B過表達(dá)抑制ESCC細(xì)胞凋亡，促進(jìn)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲。進(jìn)一步研究證實(shí)，F(xiàn)AM3B調(diào)節(jié)AKT-MDM2-p53通路和EMT的兩個(gè)核心標(biāo)記物Snail和E-鈣粘蛋白。這些發(fā)現(xiàn)提示FAM3B可能是ESCC的一個(gè)有希望的分子靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物。

使用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)、慢病毒包裝外包服務(wù)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)

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Sun H. et al: The FEN1 L209P mutation interferes with long-patch base excision repair and induces cellular transformation. Oncogene. 2016, IF=9.867

【研究?jī)?nèi)容】：FEN1是一種含特殊結(jié)構(gòu)的核酸酶，對(duì)維持人基因組的穩(wěn)定性中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)了與直腸癌相關(guān)的新FEN1突變，L209P。該突變?nèi)狈EN1的側(cè)翼內(nèi)切酶活性、外切酶活性及缺口內(nèi)切酶活性，但保留了DNA結(jié)合特性。體內(nèi)和體外的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，L209P突變能干擾野生型FEN1的功能，且對(duì)基因損傷更敏感，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因組的不穩(wěn)定和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

使用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)、慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

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