Q1：目的蛋白結(jié)合效率低或不結(jié)合怎么辦？

可能原因1：蛋白序列出現(xiàn)移碼等錯誤

解決辦法1：測序確認(rèn)，調(diào)整閱讀框以獲得GST.Tag融合表達(dá)蛋白；選擇適宜的宿主菌，如蛋白酶缺陷型大腸桿菌，稀有密碼子宿主菌Rosetta系列。

可能原因2：融合蛋白可能改變了GST 的構(gòu)象，因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。

解決辦法2：檢測所使用的pGEX 載體中GST的結(jié)合。準(zhǔn)備帶有所使用的pGEX的細(xì)胞超聲裂解物，檢測其與層析柱的結(jié)合。如果結(jié)合的很好，則可能是標(biāo)簽蛋白改變了GST 的構(gòu)象，因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的親和力?？梢酝ㄟ^降低結(jié)合的溫度到4°C限制洗滌來改善結(jié)果。

可能原因3：GST 融合蛋白發(fā)生聚集沉淀

解決辦法3：在裂解buffer和其他緩沖體系中加入DTT，經(jīng)驗(yàn)告知，1-20mM的DTT 會顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。

可能原因4：GST融合蛋白被過度稀釋

解決辦法4：重新濃縮樣品，增加蛋白濃度。

可能原因5：GST 融合蛋白被機(jī)械裂解的方法變性（比如超聲）

解決辦法5：過度超聲產(chǎn)熱會破壞標(biāo)簽蛋白，建議采用超高壓破碎。

可能原因6：結(jié)合緩沖條件不適宜

解決辦法6：低于pH6.5或高于pH8時，融合蛋白與層析柱結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低，請確認(rèn)磁珠在用于目的蛋白純化前經(jīng)過pH6.5~8.0緩沖液充分的平衡。

可能原因7：層析柱使用次數(shù)過多，雜質(zhì)干擾

解決辦法7：層析柱再生或使用新的層析柱。

Q2：目的蛋白洗脫不下來或洗脫率低是什么原因?qū)е碌模?/span>

可能原因1：洗脫緩沖液的體積太少

解決辦法1：增加洗脫緩沖液的體積。

可能原因2：洗脫緩沖液的pH過低

解決辦法2：調(diào)節(jié)洗脫緩沖液pH值至8-9 。

可能原因3：洗脫的時間不夠

解決辦法3：增加洗脫緩沖液與磁珠反應(yīng)的時間。

可能原因4：洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低

解決辦法4：增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度。

可能原因5：洗脫緩沖液中谷胱甘肽失效被氧化

解決辦法5：洗脫緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用。

可能原因6：洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度過低

解決辦法6：增加洗脫緩沖液中的離子強(qiáng)度，在洗脫緩沖液中加入0.1~0.2M的氯化鈉也會改善洗脫效果。

Q3：洗脫的蛋白中為什么含有雜質(zhì)？

可能原因1：在宿主細(xì)菌中蛋白被降解

解決辦法1：使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT，或ompT和lon雙缺陷型菌株。

可能原因2：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

解決辦法2：加入蛋白酶抑制劑PMSF。注：絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

可能原因3：細(xì)胞破碎時超聲處理過度

解決辦法3：降低裂解時間，機(jī)械裂解前加入溶菌酶（0.1 倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 ）可能會使結(jié)果變好。避免發(fā)泡，因?yàn)檫@可能使標(biāo)簽蛋白變性。過分裂解也會導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白共純化。

可能原因4：分子伴侶或許被共純化了

解決辦法4：多余的條帶可能由于共純化一些分子伴侶所造成。這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋白的正確折疊。如：DnaK（分子量70 000）、DnaJ（分子量37 000）、GrpE（分子量40 000）GroEL （分子量57 000）、GroES（分子量10 000 ）。一些從這些共純化的蛋白中分離GST融合蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表。

Q4：如何解決目的蛋白酶切后電泳檢測發(fā)現(xiàn)多條條帶？

可能原因：蛋白酶切發(fā)生在宿主細(xì)菌內(nèi)

解決辦法：檢測條帶何時出現(xiàn)：如果確定多余的條帶在Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa切割前不存在，這些條帶可能是在宿主細(xì)菌中被降解的結(jié)果。目的蛋白可能含有Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa 的切割位點(diǎn)，請檢查序列。

輝駿生物提供的GST Pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)分為以下兩種：

1. GST Pull down WB，用于體外檢測誘餌蛋白與某樣本中的待測蛋白是否存在相互作用；

2. GST Pull down MS，用于體外篩選誘餌蛋白與某樣本中的哪些蛋白具有相互作用。

GST pull down技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢*輝駿生物

GST融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例

GST pull down WB：Western blot檢測圖（陽性）

GST Pull-down MS：Western blot檢測圖

GST pulldown MS：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

GST融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)服務(wù)-輝駿生物客戶文章

1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019，IF=9.727. 【研究內(nèi)容】：前期研究表明，GYS2基因在HCC患者低表達(dá)，干擾GYS2基因表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增殖轉(zhuǎn)移。本研究通過融合表達(dá)GST-GYS2、His-p53、His-MDM2，并用GST-pull down方法，證實(shí)了MDM2與p53競爭性結(jié)合GYS2基因。相關(guān)的COIP、ChIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明GYS2基因降低腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 使用相關(guān)技術(shù): gst pulldown測定、GST-pull down質(zhì)譜分析、GST標(biāo)簽蛋白

2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015，IF=14.467. 【研究內(nèi)容】：Wnt/β-catenin信號在內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性中起重要作用。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)錄因子Bach1過表達(dá)可抑制后肢缺血小鼠的血管生成，并抑制Wnt3a刺激的血管生成反應(yīng)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Wnt/β-catenin靶基因的表達(dá)。Co-IP實(shí)驗(yàn)和gst pull-down分析表明，Bach1直接與TCF4結(jié)合，并減少β-catenin與TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血損傷后的血管生成的作用機(jī)制，為血管生成治療或其他涉及Wnt/β-catenin通路異常調(diào)節(jié)的疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。 使用相關(guān)技術(shù): GST 融合蛋白、GST pull-down實(shí)驗(yàn)、GST pull-down技術(shù)