想知道您研究的蛋白質(zhì)是否與另一種蛋白質(zhì)相互作用嗎？  您是否希望您可以聚焦您的蛋白質(zhì)以確定其結(jié)合伙伴？  您可以使用免疫共沉淀 (Co-IP) 來(lái)尋找蛋白質(zhì)的伴侶。

輝駿生物在本文將為您的 Co-IP 實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備，提供一個(gè)方便的 CoIP 協(xié)議，并討論您應(yīng)該包含的 coip 控件。  它還將涉及如何將 Co-IP 與 SPR 應(yīng)用程序一起使用，以詳細(xì)了解您的蛋白質(zhì)如何與其他蛋白質(zhì)相互作用。

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)

從本質(zhì)上講，Co-IP 只是傳統(tǒng)免疫沉淀的一個(gè)更精致的版本，可以認(rèn)為是一種小規(guī)模的親和純化。  使用這兩種技術(shù)，您都可以使用抗原/抗體相互作用來(lái)分離蛋白質(zhì)。  您感興趣的蛋白質(zhì)會(huì)被抗體“拉下”并從溶液中分離出來(lái)，而抗體又會(huì)被珠子捕獲。

然而，與傳統(tǒng) IP 相比，CoIP 需要更多的護(hù)理和更多的生理相關(guān)條件。 如果成功，Co-IP 不僅會(huì)拉下您感興趣的蛋白質(zhì)，還會(huì)拉下它的交互伙伴。 因此，Co-IP 是識(shí)別蛋白質(zhì)復(fù)合物的好方法。 此外，您可以使用 Co-IP 來(lái)確定不同條件下的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 然后，您可以繼續(xù)使用 SPR 技術(shù) 。

一個(gè)簡(jiǎn)單的免疫共沉淀協(xié)議

Co-IP 協(xié)議與傳統(tǒng)的 IP 協(xié)議非常相似，不同之處在于 Co-IP 需要更溫和的測(cè)定條件來(lái)保持與結(jié)合伙伴的相互作用。  一般步驟如下（圖1）。

圖 1：標(biāo)準(zhǔn) Co-IP 協(xié)議中的步驟。

1. 裂解你的細(xì)胞

在這里，您輕輕地打開(kāi)您的細(xì)胞，使您的蛋白質(zhì)接觸到抗體。  裂解方法在 Co-IP 中很重要。  非去污劑、低鹽裂解緩沖液是可溶性蛋白質(zhì) Co-IP 的流行選擇。  這種裂解最不可能干擾任何蛋白質(zhì)相互作用。

然而，對(duì)于溶解度較低的蛋白質(zhì)復(fù)合物，裂解緩沖液可能需要包含非離子去污劑，例如 NP-40 或 Triton X-100。 留出時(shí)間測(cè)試多種裂解條件以找到最佳裂解溶液。 科學(xué)中的一些東西，比如最好的裂解緩沖液，只需要憑經(jīng)驗(yàn)確定。

不要忘記使用 蛋白酶抑制劑 ，以免蛋白質(zhì)被蛋白酶吞噬，蛋白酶也會(huì)在細(xì)胞裂解過(guò)程中釋放出來(lái)。

數(shù)量也很重要：您使用的細(xì)胞裂解物越多，您可以提取的蛋白質(zhì)就越多。  您應(yīng)該使用的確切數(shù)量將根據(jù)您的蛋白質(zhì)的豐富程度、您是否正在拉低過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)或內(nèi)源性蛋白質(zhì)以及它與結(jié)合伙伴的相互作用程度而有所不同。   一個(gè)好的起點(diǎn)是使用至少 1 mg 的總蛋白質(zhì)，但您可能需要對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。

蛋白質(zhì)濃度也很重要 。 Co-IPs 通常在微量離心管中進(jìn)行，因此您需要確保您的細(xì)胞裂解物足夠濃縮，以適合所需量的總蛋白和其他試劑，并有移動(dòng)空間。

2. 添加您的抗體

現(xiàn)在是時(shí)候添加針對(duì)您感興趣的蛋白質(zhì)的抗體了。  為 Co-IP 選擇最佳抗體可能很困難，但許多抗體制造商在其產(chǎn)品選擇指南中提供了有用的信息。

以下是為 Co-IP 選擇優(yōu)質(zhì)抗體的一些技巧。

• 使用先前已證明可沉淀蛋白質(zhì)的抗體（例如，來(lái)自文獻(xiàn)）。

• 盡可能選擇多克隆抗體而不是單克隆抗體。  多克隆抗體將在不同位置結(jié)合您的蛋白質(zhì)，這意味著成功進(jìn)行 Co-IP 的機(jī)會(huì)更大，并最大限度地減少潛在問(wèn)題，例如您的抗體是否識(shí)別與您試圖尋找的伴侶結(jié)合的位點(diǎn)。

• 如果不能選擇多克隆抗體，請(qǐng)選擇一種抗體，該抗體可識(shí)別您感興趣的蛋白質(zhì)上未被任何其他蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用掩蓋的表位。

• 確?？贵w與天然蛋白結(jié)合；  一些抗體只識(shí)別變性蛋白質(zhì)。

3. 添加蛋白 A/G 微珠

一般來(lái)說(shuō)，珠子用于物理地從混合物的其余部分中提取和純化抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

您可以使用兩種主要類(lèi)型的珠子：涂有蛋白質(zhì) A 的珠子或涂有蛋白質(zhì) G 的珠子。蛋白質(zhì) A 和 G 是識(shí)別和結(jié)合抗體的特殊細(xì)菌蛋白質(zhì)。 您也可以得到包被蛋白 A 和蛋白 G 的珠子。抗體的種類(lèi)和類(lèi)型將決定您應(yīng)該使用這兩種珠子中的哪一種。 要確定哪一種適合您，請(qǐng)查閱您的抗體數(shù)據(jù)表。 AbCam 還有 一個(gè)有用的表格，顯示蛋白質(zhì) A、蛋白質(zhì) G、蛋白質(zhì) A/G 和蛋白質(zhì) L 珠的結(jié)合概況 。

傳統(tǒng)上，免疫沉淀珠是瓊脂糖球（直徑 50–150 μM），可通過(guò)離心純化抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。  離心方法包括使用珠漿或離心柱。離心柱通常速度很快，并且作為具有高度優(yōu)化協(xié)議的套件的一部分提供。  但是，它們可能是一個(gè)昂貴的選擇。另一方面，珠狀漿液非常適合需要非常溫和的處理且不需要高離心速度的大型復(fù)合物。

更現(xiàn)代的技術(shù)使用直徑為 1–4 μM 的磁珠代替瓊脂糖珠。  磁珠可讓您通過(guò)磁鐵分離抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物！   磁珠可能更適合高重量蛋白質(zhì)復(fù)合物和處理小體積樣品，以避免在離心過(guò)程中過(guò)多的樣品損失。   但總的來(lái)說(shuō)，瓊脂糖珠通常具有較高的產(chǎn)量，因?yàn)樗鼈兙哂羞B接多種 A/G 蛋白的大表面積。

4.孵化

這是珠子-抗體-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生的時(shí)間。  孵化時(shí)間從 30 分鐘到過(guò)夜不等，具體取決于您選擇的珠子。  通常，孵育步驟包括溫和的攪拌，例如在搖板或管旋轉(zhuǎn)器上以低速進(jìn)行，因?yàn)閿嚢钑?huì)增加相互作用的機(jī)會(huì)。

5.收集

孵育后，您需要收集抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。  根據(jù)您使用的方法，您將使用磁鐵或離心將復(fù)合物與其他細(xì)胞蛋白分離。

6.洗珠子

既然您的目標(biāo)蛋白有望通過(guò)您的抗體束縛在您的微珠上，那么是時(shí)候擺脫裂解物中的所有其他物質(zhì)了。

清洗抗體-珠子復(fù)合物幾次，以清除未與抗體特異性結(jié)合的細(xì)胞物質(zhì)。  洗滌還有助于減少“粘性”細(xì)胞成分與珠子的非特異性結(jié)合。

通常，您使用冷裂解緩沖液或冷 PBS 洗滌。  您可能需要優(yōu)化此步驟以找到不會(huì)破壞相互作用蛋白質(zhì)的正確嚴(yán)格程度。

輝駿提示： 在此步驟中保存所有使用過(guò)的洗滌緩沖液。 洗滌緩沖液可以顯示您的目的蛋白和任何伴侶蛋白是否已從裂解物中耗盡。 這是對(duì)您的 Co-IP 進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵知識(shí)！

7. 洗脫您的蛋白質(zhì)

大多數(shù) SDS-PAGE 上樣緩沖液會(huì)減少和變性蛋白質(zhì)。  因此，將蛋白質(zhì)與珠子分離通常是一種有效的方法。  如果您計(jì)劃使用 SDS-PAGE 作為您的檢測(cè)方法（我們大多數(shù)人都這樣做），那么您可以直接將負(fù)載添加到珠子上以收集您的蛋白質(zhì)。

如果您想使用天然 PAGE 協(xié)議檢測(cè)您的蛋白質(zhì)，或者您計(jì)劃對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶測(cè)定，那么您可能需要使用 SDS-PAGE 上樣緩沖液以外的其他物質(zhì)進(jìn)行洗脫。

常用的非變性洗脫緩沖液是 0.1M 甘氨酸，低 pH 值（約 2.5–3）。  然而，一些蛋白質(zhì)在這些條件下仍然會(huì)變性或失去酶活性，并且一些蛋白質(zhì)可能不會(huì)通過(guò)這種處理解離。  因此，將其歸結(jié)為另一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。

8. 檢測(cè)您的蛋白質(zhì)

至此，您已經(jīng)分離出您的蛋白質(zhì)，可以開(kāi)始使用了。  現(xiàn)在是令人興奮的部分……看看你分離的感興趣的蛋白質(zhì)及其舞伴。  想怎么做SDS-PAGE、質(zhì)譜、酶分析等取決于你。

輝駿提示： 請(qǐng)記住，您用于純化蛋白質(zhì)的抗體也與您的目標(biāo)蛋白質(zhì)一起在洗脫液中。 這種抗體污染可能是個(gè)問(wèn)題。 蛋白質(zhì)印跡可能會(huì)檢測(cè)到您的洗脫液中的抗體，因此如果您的目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量接近，則它們會(huì)掩蓋對(duì)它們的檢測(cè)。 （抗體重鏈和輕鏈的分子量分別約為 50 和 25 kD。）

您可以通過(guò) 1) 使用與抗體共價(jià)結(jié)合的磁珠，或 2) 確保為您的蛋白質(zhì)印跡選擇的二抗識(shí)別與您的 Co-IP 抗體不同的物種，從而克服這個(gè)問(wèn)題。

9. 研究與表面等離子共振應(yīng)用的相互作用

Co-IP 中的積極發(fā)現(xiàn)是個(gè)好消息，但你應(yīng)該緩和你的興奮。 許多科學(xué)家被粘性蛋白質(zhì)誤入歧途。 您應(yīng)該進(jìn)行額外的研究以確認(rèn)任何潛在的相互作用并確保它們是特定的。 例如，您可以使用突變分析來(lái)繪制結(jié)合位點(diǎn)圖。 或者，有關(guān)交互的更具體信息，請(qǐng)考慮使用 SPR 應(yīng)用程序 。

SPR 應(yīng)用程序不僅可以確認(rèn)結(jié)合伙伴之間的相互作用，還可以實(shí)時(shí)定量測(cè)量這些相互作用的親和力、熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)。

SPR 生物傳感器 有助于對(duì)感興趣的相互作用進(jìn)行熱力學(xué)分析。 使用 SPR，您可以自信地比較您感興趣的蛋白質(zhì)和不同結(jié)合伙伴之間的親和力。SPR 的一個(gè)主要實(shí)際優(yōu)勢(shì)是您不需要標(biāo)記您感興趣的蛋白質(zhì)（因此不再需要標(biāo)記克隆或放射性），從而為您節(jié)省時(shí)間并避免使用棘手的克隆策略帶來(lái)的潛在麻煩。

如果您想檢測(cè)和解開(kāi)免疫受體與其配體之間的相互作用，您可能需要考慮嘗試 生物傳感器分析 。生物傳感器分析允許您測(cè)量配體與其特定抗原受體的結(jié)合和解離速率。 這些測(cè)定遵循 SPR 原則。 由于其優(yōu)勢(shì)和巨大的能力，SPR 及其相關(guān)應(yīng)用已成為動(dòng)力學(xué)和親和力測(cè)定的黃金標(biāo)準(zhǔn)，而 SPR 原理強(qiáng)調(diào)了大多數(shù)基于顏色的 生物傳感器芯片 應(yīng)用。

免疫共沉淀對(duì)照

控制對(duì)于了解您的實(shí)驗(yàn)是否有效并在事情沒(méi)有完全解決時(shí)進(jìn)行故障排除至關(guān)重要。  您可以為 Co-IP 使用多種不同的控件（圖 2）。

圖 2：免疫共沉淀的示例對(duì)照

陰性對(duì)照

這些控件表明您在實(shí)驗(yàn)中看到的任何交互都是有效的。  使用涂有非特異性抗體的珠子，在您的裂解物中孵育并與您的樣品一樣處理。  最好從與實(shí)驗(yàn)中的抗體相同的物種中選擇一種，以更好地模擬任何非特異性結(jié)合。

您也可以只使用沒(méi)有任何抗體的瓊脂糖珠，反之亦然，以確定任何非特異性結(jié)合的確切原因。

如果您在此對(duì)照中看到您感興趣的蛋白質(zhì)或潛在的結(jié)合伙伴，則您有非特異性結(jié)合，您需要查看您的協(xié)議。

陽(yáng)性對(duì)照

檢查總裂解物中是否存在您的蛋白質(zhì)/潛在結(jié)合伴侶（未進(jìn)行任何珠子/Co-IP）。  這可以確保如果您沒(méi)有看到您感興趣的蛋白質(zhì)，這不是由于裂解物或檢測(cè)方法的問(wèn)題。如果您的蛋白質(zhì)在總裂解物中，但不在 IP 中，則需要對(duì)每個(gè)步驟進(jìn)行故障排除以確保 IP 正常工作。純化的重組蛋白可用于確保您的檢測(cè)方法有效——這可能適用于被拉下的蛋白質(zhì)或潛在的相互作用蛋白質(zhì)。

coip免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的更多提示

當(dāng)然，在這些步驟中，有很多變數(shù)可以讓你的 Co-IP 成功，或者最后讓你一臉悲傷。  并且有無(wú)數(shù)的公司、產(chǎn)品和套件可供您選擇。  因此，為一些試驗(yàn)和錯(cuò)誤做好準(zhǔn)備！

在我們結(jié)束之前，這里有一些專(zhuān)家提示，可以巧妙地窺探您的蛋白質(zhì)相互作用，而不會(huì)過(guò)多地打擾它們。

預(yù)先清除您的裂解物

在引入抗體之前，通過(guò)在裂解物中添加蛋白 A/G 珠子來(lái)“預(yù)清除”您的裂解物。  接下來(lái)，旋轉(zhuǎn)珠子并丟棄它們，以拉出任何非特異性粘附在珠子上的細(xì)胞成分。  然后添加您的抗體/珠子并繼續(xù)。

預(yù)清除有助于減少非特異性結(jié)合并降低潛在背景。  但是，如果您計(jì)劃在 Co-IP 結(jié)束時(shí)使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)您的蛋白質(zhì)，則可能不需要預(yù)先清除，除非您知道污染蛋白質(zhì)可能會(huì)干擾您的蛋白質(zhì)/感興趣的條帶。

仔細(xì)計(jì)劃訂單

將磁珠引入抗體是影響產(chǎn)量的重要變量。  通常，抗體通過(guò)在引入裂解物之前將它們一起孵育而固定在珠子上。  但是，如果目標(biāo)蛋白的濃度較低，或者抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力較弱，則可能需要先孵育蛋白和抗體，然后再添加磁珠。

溫柔一點(diǎn)，慢一點(diǎn)

您的目標(biāo)是保持蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。  您的抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物將被蛋白 A 或 G 結(jié)合珠從溶液中物理拉出。  雖然從珠子到抗體的束縛是高度特異性的，但它是脆弱的。

因此，請(qǐng)用天鵝絨手套處理您的細(xì)胞裂解物。  這包括選擇正確的裂解方法、保持樣品冷藏以及避免過(guò)度處理。

渦旋、用小移液器吸頭混合或在離心機(jī)中使用高速旋轉(zhuǎn)都可以分解您的蛋白質(zhì)-抗體-珠子鏈，并將您的蛋白質(zhì)拋回溶液中。

保持溫度

為防止裂解物中的蛋白質(zhì)降解或改變，請(qǐng)?jiān)?4°C 下進(jìn)行 CoIP。  冷藏室是完美的，特別是如果您可以將所有設(shè)備（例如，搖桿/離心機(jī)）設(shè)置在觸手可及的地方。

免疫共沉淀總結(jié)

Co-IP 是一種有用且相對(duì)簡(jiǎn)單的工具，可用于識(shí)別蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。本文中提供的coip實(shí)驗(yàn)協(xié)議和技巧希望能幫助確保您獲得出色且有意義的結(jié)果！

輝駿生物提供的Co-IP免疫共沉淀服務(wù)分為以下兩種：

1. Co-IP WB，用于檢測(cè)某樣本中的誘餌蛋白和待測(cè)蛋白是否存在相互作用；

2. Co-IP MS，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白與哪些蛋白具有相互作用。

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免疫共沉淀coip實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖例—輝駿生物

Co-IP WB：Western blot檢測(cè)圖（陽(yáng)性）

Co-IP MS：Western blot檢測(cè)圖（陽(yáng)性）

Co-IP MS：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)實(shí)驗(yàn)—輝駿生物客戶(hù)文章

1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019，IF=13.256. 【研究?jī)?nèi)容】：客戶(hù)發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體成分之一的FREE1基因，受到脫落酸刺激時(shí)候會(huì)發(fā)生磷酸化并移位到細(xì)胞核?？蛻?hù)利用酵母雙雜交技術(shù)找到兩個(gè)核蛋白ABF4 and ABI5會(huì)與FREE1結(jié)合，免疫共沉淀CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FREE與這兩個(gè)蛋白的互作。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)REE1通過(guò)抑制ABF4、ABI5對(duì)下游基因的調(diào)控能力，參與了脫落酸信號(hào)通路。 使用相關(guān)技術(shù)：質(zhì)譜鑒定、免疫共沉淀CoIP、Co-IP MS實(shí)驗(yàn)

2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019，IF= 9.727. 【研究?jī)?nèi)容】：客戶(hù)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選出膽固醇致前列腺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）的重要基因APMAP和EGFR。通過(guò)在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)3*Flag-APMAP基因，并利用免疫共沉淀CoIP及質(zhì)譜鑒定技術(shù)，客戶(hù)發(fā)現(xiàn)EPS15R可與APMAP結(jié)合。進(jìn)一步的研究證實(shí)，體內(nèi)EPS15R-APMAP復(fù)合物通過(guò)EGFR致使細(xì)胞發(fā)生EMT。 使用相關(guān)技術(shù)：蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜鑒定、免疫共沉淀CoIP

3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=10.717. 【研究?jī)?nèi)容】：前期研究表明UBAP2L蛋白參與應(yīng)激顆粒形成?？蛻?hù)在這項(xiàng)研究中，用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)PRMT1甲基化UBAP2L，UBAP2L蛋白并且和另外三個(gè)應(yīng)激顆粒形成有關(guān)的重要蛋白有相互作用。這些蛋白復(fù)合物介導(dǎo)了應(yīng)激顆粒的形成。 使用相關(guān)技術(shù)：CoIP技術(shù)服務(wù)、質(zhì)譜鑒定、修飾位點(diǎn)鑒定

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