蛋白質(zhì)磷酸化實(shí)驗(yàn)原理、主要類型和功能介紹

蛋白質(zhì)磷酸化是指由蛋白激酶催化，將ATP或GTP的γ位磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等）上的過程。蛋白質(zhì)磷酸化是體內(nèi)常見的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。幾乎所有的蛋白質(zhì)在合成過程中或合成后都會發(fā)生某種形式的修飾。異常的翻譯后修飾與疾病的發(fā)生有關(guān)。某些特定的翻譯后修飾被開發(fā)為疾病的分子標(biāo)記或治療靶點(diǎn)。最常見和最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)磷酸化是將外部刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號的主要機(jī)制。

在磷酸化反應(yīng)中，在蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈上加入一個帶強(qiáng)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，引起酯化作用，從而改變其與其他分子相互作用的構(gòu)型、活性和性能。酯化調(diào)節(jié)許多生物過程，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和細(xì)胞分裂。編碼的蛋白質(zhì)只會被特定的氨基酸磷酸化。在真核生物中，主要被絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基磷酸化。在細(xì)菌中，殘基如天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。一些蛋白質(zhì)在原核生物和真核生物中都被磷酸化，它們的磷酸化位點(diǎn)通常是精氨酸、賴氨酸和半胱氨酸殘基。可逆的蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的大部分功能，如能量儲存、形態(tài)變化、蛋白質(zhì)合成、基因表達(dá)、信號因子釋放、肌肉收縮和生化代謝。因此，蛋白質(zhì)磷酸化分析和位點(diǎn)鑒定已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)之一。

蛋白質(zhì)磷酸化的主要類型和功能

根據(jù)磷酸氨基酸殘基的不同，磷酸化蛋白可分為4類：O-磷酸蛋白、N-磷酸蛋白、?；姿岬鞍缀蚐-磷酸蛋白

1. O-磷酸蛋白是由羥基氨基酸（如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸）磷酸化形成的，但羥基脯氨酸或羥基賴氨酸的磷酸化作用尚不清楚。

2. N-磷酸蛋白由精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成。

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4. S-磷酸蛋白由半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白質(zhì)磷酸化的功能是多種多樣的

1. 參與其他重要的酶促反應(yīng)（磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物，多為S或N磷酸鹽等）

2. 介導(dǎo)蛋白質(zhì)活性（蛋白質(zhì)分子通過蛋白激酶的磷酸化改變性能），例如蛋白激酶 A（磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基）或各種受體酪氨酸激酶（磷酸化酪氨酸殘基）

3. 發(fā)揮多種獨(dú)特的生理作用。例如，天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸磷酸化蛋白在細(xì)菌趨化反應(yīng)的感覺傳遞中解離。某些激素也以特定磷酸化蛋白的形式存在于靶組織中。

蛋白質(zhì)磷酸化的研究方法

近年來，更多的研究集中在蛋白質(zhì)磷酸化上。一些主題包括確定蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性磷酸化、植物蛋白磷酸化和動物神經(jīng)細(xì)胞磷酸化。新的研究方法不斷涌現(xiàn)。最廣泛使用的技術(shù)是質(zhì)譜和同位素標(biāo)記結(jié)合免疫印跡-化學(xué)發(fā)光分析。

質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜法是利用電場和磁場，根據(jù)質(zhì)荷比檢測帶電運(yùn)動粒子（包括原子、分子甚至分子結(jié)構(gòu)片段）的物理和化學(xué)性質(zhì)的方法。核素的精確質(zhì)量是小數(shù)位數(shù)。任何兩種核素的質(zhì)量都是不同的，一種核素的質(zhì)量并不完全是另一種核素的整數(shù)倍。因此，通過測量帶電粒子（離子）的精確質(zhì)量，可以確定相應(yīng)的化合物組成、結(jié)構(gòu)和裂化規(guī)律。

與未修飾的多肽相比，磷酸基修飾的多肽的相對分子質(zhì)量增加了79.983。磷酸肽的產(chǎn)生意味著片段離子結(jié)構(gòu)可用于診斷，這與未修飾的肽不同。質(zhì)譜法可用于鑒定蛋白質(zhì)磷酸化。通過使用特定序列水解酶（如胰蛋白酶）水解凝膠分離的蛋白質(zhì)，獲得不同的肽。高效液相色譜用于分離感興趣的肽，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

同位素標(biāo)記結(jié)合免疫印跡-化學(xué)發(fā)光分析

該方法使用放射性同位素標(biāo)記、二維電泳和放射自顯影來建立蛋白質(zhì)組圖。通過免疫印跡持久化學(xué)發(fā)光可以選擇性地識別和分析目標(biāo)蛋白，也可以用于同時比較多個樣品中相同蛋白的表達(dá)。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被磷酸化時，放射性 32 P的摻入和分子質(zhì)量的變化會引起凝膠位移，這使得免疫印跡在分析檢測中占有重要地位。

當(dāng)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量以光的形式釋放出來時，稱為化學(xué)發(fā)光。例如，最常用的化學(xué)發(fā)光試劑之一魯米諾被過氧化物氧化產(chǎn)生氨基鄰苯二甲酸酯。當(dāng)該產(chǎn)物衰變?yōu)榈湍軕B(tài)時，會釋放出一個光子。使用獲得專利的添加劑來增加發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光反應(yīng)的持續(xù)時間（穩(wěn)定性），生產(chǎn)了一種增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光 (ECL) 試劑。在使用 ECL 的免疫印跡中，當(dāng)酶和反應(yīng)底物相互作用時，化學(xué)發(fā)光劑會產(chǎn)生可檢測的光。特定抗體在適當(dāng)稀釋濃度下產(chǎn)生的穩(wěn)定光信號輸出有助于保持蛋白質(zhì)檢測的一致性和靈敏度。

磷酸化位點(diǎn)鑒定實(shí)驗(yàn)服務(wù)-輝駿生物

磷酸化是細(xì)胞信號通路中重要的共價翻譯后修飾 (PTM)。這種修飾是一個可逆過程，由蛋白激酶催化。研究表明，超過 30% 的真核蛋白質(zhì)會發(fā)生磷酸化。磷酸化修飾對靶蛋白主要有兩種調(diào)控機(jī)制：（1）磷酸化可能引起修飾蛋白如酶、受體等結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，從而“開啟”或“關(guān)閉”功能。 (2) 磷酸化改變了蛋白質(zhì)對其效應(yīng)子的親和力，通過這樣做，磷酸化的蛋白質(zhì)可以募集或釋放其下游效應(yīng)子。因此，可以想象磷酸化修飾調(diào)節(jié)廣泛的生物活動，例如細(xì)胞生長、細(xì)胞代謝、細(xì)胞分裂等。

磷酸化可能發(fā)生在真核生物中的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基上。在這四種類型的磷酸化中，酪氨酸磷酸化是最罕見的，但非常關(guān)鍵。最著名的酪氨酸激酶受體位于 MAPK 通路的最上游，調(diào)節(jié) Ras 和其他激酶，啟動磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。

通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，可以對目前已知的各種蛋白修飾類型（如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、琥珀?；龋┖鸵恍┬》肿铀幬镌诘鞍咨系男揎椢稽c(diǎn)進(jìn)行鑒定。