在細(xì)胞培養(yǎng)中使用氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記 (SILAC) 是一種基于質(zhì)譜的強(qiáng)大方法，可識(shí)別和量化蛋白質(zhì)豐度的相對(duì)差異變化。  2002 年首次用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)，它提供準(zhǔn)確的相對(duì)定量，無需任何化學(xué)衍生或操作。

SILAC實(shí)驗(yàn)原理

圖 1. SILAC 的實(shí)驗(yàn)原理

SILAC原理是基于代謝將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸整合到整個(gè)蛋白質(zhì)組中。  在 SILAC 中，兩個(gè)細(xì)胞群在兩種不同的培養(yǎng)基中生長，一種是含有天然同位素氨基酸的“輕”培養(yǎng)基，另一種是含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸的“重”培養(yǎng)基。   在足夠數(shù)量的細(xì)胞分裂后，在“重”培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)都含有處于重狀態(tài)的氨基酸。  使用 LC-MS/MS 分析，SILAC 的定量基于測試引入的同位素標(biāo)記肽與未標(biāo)記肽的比率。  來自輕質(zhì)和重質(zhì)樣品的信號(hào)強(qiáng)度可以定量比較它們?cè)诨旌衔镏械南鄬?duì)豐度。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記SILAC實(shí)驗(yàn)流程

圖2. 穩(wěn)定同位素標(biāo)記SILAC實(shí)驗(yàn)流程

SILAC實(shí)驗(yàn)可以分為兩個(gè)階段：適應(yīng)階段和實(shí)驗(yàn)階段。   在適應(yīng)階段，細(xì)胞在輕質(zhì)和重質(zhì) SILAC 培養(yǎng)基中生長，直到重質(zhì)氨基酸完全摻入生長的細(xì)胞中，這可以通過 MS 進(jìn)行評(píng)估。   在實(shí)驗(yàn)階段，根據(jù)研究目的對(duì)兩個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行不同的處理。  隨后，研究混合細(xì)胞群或蛋白質(zhì)裂解物。  然后用 LC-MS/MS 分析樣品以識(shí)別和量化重肽與輕肽的比率。

SILAC的應(yīng)用

SILAC 與 LC-MS/MS 聯(lián)用已廣泛用于表征不同樣品之間的蛋白質(zhì)定量差異，研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM) 的變化，以及區(qū)分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)中的特定相互作用蛋白質(zhì)。  SILAC 有多種應(yīng)用。

1. 表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)： SILAC 提供了一種 體內(nèi) 策略來標(biāo)記具有不同氨基酸穩(wěn)定同位素形式的蛋白質(zhì)，這使得在不同條件下監(jiān)測蛋白質(zhì)水平的定量差異成為可能。 此外，SILAC 還用于鑒定細(xì)胞器中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞核、核仁或細(xì)胞胰島素分泌顆粒。

2. PTM 的動(dòng)態(tài)變化： 對(duì)于 PTMomics 分析，SILAC 標(biāo)記肽需要經(jīng)過分級(jí)分離和富集步驟，以改進(jìn) PTM 肽的鑒定。 結(jié)合 MS 技術(shù)，SILAC 可以對(duì) PTM 進(jìn)行全局和動(dòng)態(tài)分析，包括磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化、甲基化。 例如，研究人員使用 SILAC 和固定化金屬親和層析 (IMAC) 進(jìn)行磷酸肽富集，以量化 G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路中蛋白質(zhì)響應(yīng)酵母信息素信號(hào)的磷酸化變化。

3. PPI 研究：在研究 PPI 時(shí)，蛋白質(zhì)復(fù)合物從 SILAC 標(biāo)記的細(xì)胞裂解物的混合物中免疫沉淀。 結(jié)合 SILAC，可以有效地區(qū)分特異性相互作用的蛋白質(zhì)和非特異性背景蛋白質(zhì)。 從誘餌樣品中純化的特定相互作用伙伴的豐度顯著高于從對(duì)照樣品中純化的，從而導(dǎo)致量化比率遠(yuǎn)高于 1。相比之下，誘餌和對(duì)照中非特異性背景蛋白的豐度應(yīng)具有可比性樣本，使得它們的比率接近 1。基于 SILAC 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)可用于鑒定研究外源性 PPI、內(nèi)源性 PPI 或誘導(dǎo)型 PPI 中的特異性相互作用蛋白。

SILAC 是一種簡單而強(qiáng)大的蛋白質(zhì)定量分析方法，其特點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。 差異處理的樣品可以在完整細(xì)胞或蛋白質(zhì)的水平上組合，即在實(shí)驗(yàn)工作流程的第一步，并且可以一起處理以最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤差或偏差，但它只適用于細(xì)胞樣本，細(xì)胞培養(yǎng)需要很長時(shí)間。 

輝駿實(shí)力