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若打算將目的蛋白應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)，那么成功表達(dá)重組蛋白是很重要的環(huán)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)開始前，需要你花點(diǎn)時(shí)間優(yōu)化蛋白的可溶性，將會(huì)大大節(jié)約你后續(xù)純化的時(shí)間。關(guān)于重組蛋白表達(dá)和純化，可參考如下建議：

標(biāo)簽中有什么？

選擇“正確”標(biāo)簽可能是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。理想的標(biāo)簽將幫助你獲得可溶性蛋白，簡化你的純化方案，并且不會(huì)干擾下游應(yīng)用。然而，考慮到載體可用的切割位點(diǎn)過多，你唯一的擔(dān)心應(yīng)該是哪個(gè)標(biāo)簽將有助于目標(biāo)蛋白的溶解、表達(dá)和純化—標(biāo)簽總是可以切除的，如果你擔(dān)心它會(huì)干擾目標(biāo)蛋白的行為。

某些標(biāo)簽，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）或麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）被認(rèn)為可增加蛋白的溶解性。這些標(biāo)簽的缺點(diǎn)是它們的大小—GST約26kDa，MBP為41kDa。 其他標(biāo)簽（六聚組氨酸，F(xiàn)LAG，鏈霉親和素）相對較小，通常選擇它們以便于捕獲和純化。 選擇幾個(gè)不同的標(biāo)簽，然后克??！如果可能的話，使用C端標(biāo)簽，這意味著你純化的任何蛋白將是全長，沒有任何截?cái)唷?/span>

獲得可溶性蛋白

重組蛋白表達(dá)的常見問題是真核蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)傾向于不溶。變性，聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵體，需要進(jìn)一步純化和重折疊，這可能是低效的和不完全的。

以下是獲得可溶性天然蛋白質(zhì)的三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：

IPTG濃度

有可能，宿主中的蛋白表達(dá)將通過lac操縱子系統(tǒng)操作。這個(gè)系統(tǒng)的詳細(xì)解釋可以在別處找到，你加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），一種乳糖類似物，控制蛋白的表達(dá)。蛋白的表達(dá)應(yīng)處于生長的對數(shù)期，即當(dāng)溶液的波長600（OD 600）處的光密度達(dá)到0.4-0.6。 如果你的目標(biāo)是可溶性蛋白質(zhì)，最好不要改變細(xì)胞中蛋白的折疊功能。已經(jīng)假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侶的存在。因此，使用高濃度的IPTG（> 1mM）可能不總是產(chǎn)生最好的結(jié)果。嘗試幾個(gè)不同的濃度，看看哪一個(gè)給你最高的可溶性蛋白的產(chǎn)量。

溫度

偶爾，你可以在37°C的典型溫度下，通過生長和誘導(dǎo)分離可溶性形式的蛋白質(zhì)，但通常情況下，溶解度在較低溫度下增強(qiáng)?？蓢L試在30°C，25°C和18°C下進(jìn)行誘導(dǎo)。 注意：如果首先在37℃生長，先讓培養(yǎng)物冷卻到誘導(dǎo)溫度，再加入IPTG。

誘導(dǎo)時(shí)間

更長并不總是更好。對于對宿主有毒的蛋白尤其如此。在誘導(dǎo)期間，每隔幾個(gè)小時(shí)取樣，并檢查目的蛋白的表達(dá)。典型的誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)溫度而變化：對于37℃，嘗試4小時(shí);對于30℃，進(jìn)行5-6小時(shí)，并且任何低于25℃的溫度應(yīng)該允許生長過夜。

預(yù)實(shí)驗(yàn)

將目的蛋白的編碼序列克隆到具有不同標(biāo)記（例如六組氨酸，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST），麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP））的2-3個(gè)載體中。然后選擇三種不同的誘導(dǎo)時(shí)間和溫度以及幾種IPTG濃度。進(jìn)行小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)后，分析每個(gè)樣本中的（1）未誘導(dǎo)樣本；（2）在不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)樣本；（3）裂解物；（4）可溶性片段。

以上建議都沒有達(dá)到預(yù)期的效果？

雖然遵循了上面的建議，你可能會(huì)發(fā)現(xiàn)，你仍然無法獲得可溶性蛋白，或許可嘗試如下解決方案：

只表達(dá)目標(biāo)蛋白的一部分：較小的結(jié)構(gòu)域通常是可溶的，即使全長蛋白不是；

使用不同的表達(dá)系統(tǒng)：這甚至可能保留目標(biāo)蛋白的翻譯后修飾；

在變性條件下純化：雖然不總是最好的方法，在變性條件下（即在高濃度的胍或尿素的離液鹽中）純化有時(shí)是唯一的解決方案。通常這些條件可以給你一個(gè)更純的樣品，因?yàn)榭扇苄晕廴镜鞍妆灰瞥?。唯一的問題是重折疊；然而，有許多方案可用于包涵體蛋白的重折疊。