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如果您要進(jìn)行定量PCR（qPCR），那么了解Ct值。下面 我們將帶您了解它在qPCR中的關(guān)鍵作用。

一、在深入解釋Ct值是什么之前，我們想花一點(diǎn)時(shí)間強(qiáng)調(diào)一下，多年來(lái)該值已被賦予多個(gè)名稱，包括：

1.Ct–循環(huán)閾值

2.Cp–交點(diǎn)

3.TOP-分支點(diǎn)

4.Cq–定量循環(huán)

這幾個(gè)名字表達(dá)的都是一個(gè)意思。由于實(shí)時(shí)定量qPCR實(shí)驗(yàn)指南建議使用Cq值來(lái)命名該值，因此，接下來(lái)的內(nèi)容，我們將統(tǒng)一使用Cq值來(lái)表示。

 二、Cq值的定義  

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

1.閾值：

以 PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，一般熒光域值定義為 3~15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。

2.CT值：

也稱循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。其含義是:在PCR 循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

三、常見(jiàn)問(wèn)題

1.預(yù)混液

Cq值會(huì)隨著熒光發(fā)射的變化而變化，而熒光發(fā)射受溶液中pH值和鹽濃度的影響，因此，請(qǐng)確保僅使用高質(zhì)量的PCR組件，如使用自制溶液，每次實(shí)驗(yàn)前要檢查pH值和鹽沉淀監(jiān)測(cè)。

2.被動(dòng)參比染料

反應(yīng)值是FAM熒光染料與ROX參比染料的比值。假設(shè)FAM熒光不變，ROX的用量越少，反應(yīng)值越高。

3.模板太少–嘗試使用更多模板。

參考文獻(xiàn)

1.Bustin SA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009. 55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.

2.C. Schrader, et al. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Applied Microbiology. 113(5):1014-26. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.