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了解與研究蛋白質(zhì)間的相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI），是理解細(xì)胞內(nèi)發(fā)生若干生物化學(xué)活動(dòng)的第一步。在眾多的PPI研究方法中，通常將蛋白質(zhì)分為誘餌蛋白與獵物蛋白，利用酵母的生長(zhǎng)（Y2H），觀察活體細(xì)胞中的熒光（熒光能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET或雙分子熒光互補(bǔ)，Bimolecular Fluorescent Complementation，BiFC）以及采用各類體內(nèi)與體外的沉淀法（免疫沉淀或親和純化等）等方法，檢測(cè)誘餌蛋白與獵物蛋白之間的相互作用【1】。

難以避免的是，每種方法都具有局限性，必須基于一種以上的PPI方法，才可以得出可信的結(jié)果【1】。雖然，這些方法都在植物PPI的研究中較為廣泛的應(yīng)用，但是，我們?nèi)孕枰l(fā)展新的PPI方法，尤其能夠解決現(xiàn)有方法的局限性。雷帕霉素（Rapamycin）作為一種化學(xué)分子，能夠介導(dǎo)分別含有FKBP（FK506-Binding Protein）結(jié)構(gòu)域與FRB（FKBP-Rapamycin-Binding）結(jié)構(gòu)域的蛋白形成異二聚體。雷帕霉素與FKBP結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合體，并進(jìn)一步與FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

利用這一特性，前人在人類細(xì)胞中創(chuàng)建了用于研究蛋白功能的Knocksideways系統(tǒng)【2】。將線粒體定位信號(hào)、熒光蛋白與FRB結(jié)合為線粒體錨定蛋白（圖1，綠色蛋白），同時(shí)，將待檢測(cè)蛋白與FKBP結(jié)構(gòu)域相連（圖1，紅色蛋白），在施加雷帕霉素后，待檢測(cè)蛋白會(huì)重定位于線粒體中。由于待檢測(cè)蛋白的非正常定位，無法發(fā)揮其功能，配合其他檢測(cè)方法可以研究其功能【2】，可用于研究對(duì)象突變體致死的環(huán)境下。雷帕霉素能夠形成二聚體的作用已經(jīng)在不同類型的生物體中得以應(yīng)用【3-5】，但少見于植物細(xì)胞中【1】。

2021年1月25日，來自比利時(shí)根特大學(xué)Dani?l Van Damme團(tuán)隊(duì)在 The Plant Cell發(fā)表了題為Visualizing protein-protein interactions in plants by rapamycin-dependent delocalization的研究論文。該研究利用雷帕霉素能夠調(diào)控異二聚體在細(xì)胞內(nèi)的形成這一過程，創(chuàng)建若干不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位信號(hào)的FRB融合蛋白，利用熒光共聚焦顯微鏡，選取已知互作蛋白，驗(yàn)證并建立，可應(yīng)用于植物細(xì)胞中的KSP（Knocksideways in plants）蛋白互作檢測(cè)系統(tǒng)，并且探討了其適用性與局限性，提出了進(jìn)一步改進(jìn)的方法。

在該研究中，作者基于Knocksideways系統(tǒng)【2】，結(jié)合已知的研究結(jié)果，利用MultiSite Gateway技術(shù)，創(chuàng)建了融合不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位信號(hào)的FRB蛋白（定位信號(hào)-熒光分子-FRB），包括微管、細(xì)胞核、線粒體以及細(xì)胞膜。在熒光共聚焦顯微鏡的觀察下，煙草表皮細(xì)胞中，連接不同信號(hào)分子的FRB融合蛋白都能夠定位于相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。作者進(jìn)一步，將細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位與FRB融合蛋白不同的誘餌蛋白，連接 FKBP蛋白（誘餌蛋白-mCherry-FKBP或FKBP-mCherry-誘餌蛋白），共同在煙草中表達(dá)兩個(gè)融合蛋白。施用雷帕霉素后，融合FKBP的誘餌蛋白在雷帕霉素的作用下，重新定位于含有FRB融合蛋白的細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。至此，驗(yàn)證了雷帕霉素在植物細(xì)胞中，能夠介導(dǎo)異二聚體形成。在此基礎(chǔ)上，作者利用已知的蛋白相互作用，將獵物蛋白與GFP蛋白相連，在施加雷帕霉素后，獵物蛋白與誘餌蛋白能夠共定位在特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。比如，利用KSP系統(tǒng)，重現(xiàn)了SACL蛋白與LHW蛋白的互作【6】。

在雷帕霉素處理后，熒光信號(hào)位于細(xì)胞核中的SACL-GFP與LHW-mCherry-FKBP，轉(zhuǎn)移到了線粒體上，與線粒體定位的MITO-TagBFP2-FRB信號(hào)重疊?；谝陨辖Y(jié)果，表明KSP系統(tǒng)具有可誘導(dǎo)性。此外，為了探討KSP的可逆性與穩(wěn)定性，作者引入了雷帕霉素的拮抗物子囊霉素（Ascomycin），其能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FKBP結(jié)構(gòu)域【7】。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雷帕霉素處理后，5分鐘內(nèi)就可以觀察到熒光信號(hào)的重定位現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，再經(jīng)歷子囊霉素處理，熒光信號(hào)重定位現(xiàn)象仍然能在24小時(shí)后觀察到。為了對(duì)蛋白質(zhì)重定位進(jìn)行定量分析，作者也提供了基于ImageJ/Fiji軟件的腳本與操作手冊(cè)，在圖片標(biāo)準(zhǔn)化處理后，配合腳本實(shí)現(xiàn)了圖片批量處理，可以對(duì)施加雷帕霉素前后，熒光信號(hào)位置變化進(jìn)行相對(duì)定量。隨后，作者也探討了KSP的局限性。在該系統(tǒng)中，定位于細(xì)胞核中的KRP2蛋白，在雷帕霉素處理后，無法觀察到較為明顯的重定位現(xiàn)象。

最后，作者探討了KSP系統(tǒng)的前景與改進(jìn)方向。比如兩個(gè)以上蛋白間的相互作用，特定細(xì)胞區(qū)域中酶促反應(yīng)研究與條件性“敲除”基因等。在改進(jìn)方向上，提出通過引入組織特異性啟動(dòng)子，或?qū)⒍鄠€(gè)表達(dá)框整合到同一載體上等方法，有望拓展KSP系統(tǒng)的適用性。

總而言之，基于文章中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，KSP系統(tǒng)是一個(gè)在植物細(xì)胞中研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。作者通過改進(jìn)Knocksideways系統(tǒng)【2】，使之較為系統(tǒng)性地應(yīng)用于植物細(xì)胞中PPI研究，相比較于其他適用于植物細(xì)胞中的系統(tǒng)具有特定優(yōu)勢(shì)。1. 雷帕霉素施用與否，本身可以作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。在施用后，極短時(shí)間內(nèi)就能觀測(cè)到結(jié)果，且可持續(xù)至24小時(shí)。2. KSP相較于BiFC與FRET，其相互作用結(jié)果讀取，并不依賴熒光基團(tuán)的互補(bǔ)或基團(tuán)之間的空間距離。但是，KSP系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白互作中具有一定的局限性。相對(duì)于可移動(dòng)性較高的蛋白（如定位于微管與細(xì)胞質(zhì)），或具有多種亞細(xì)胞定位的蛋白，有特定且穩(wěn)定分布的蛋白(比如位于細(xì)胞核的KRP2)， KSP的作用不明顯。再者，KSP表現(xiàn)出可以檢測(cè)兩個(gè)以上蛋白的相互作用，但無法了解第三個(gè)蛋白是促進(jìn)或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。有需要的讀者，可以參考近期發(fā)表在Plant Physiology上利用酵母，檢測(cè)第三個(gè)蛋白如何調(diào)控蛋白互作的Tri-SUS系統(tǒng)【8】。

參考文獻(xiàn)
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