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中文標(biāo)題：弓形蟲毒力和無毒菌株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了菌株特異性模式

發(fā)表期刊：Oncotarget

影響因子：5.168

發(fā)表時間：2017年7月

合作單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

運(yùn)用技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

頂端復(fù)合體原生動物寄生蟲弓形蟲具有感染多種哺乳動物、鳥類和人類的顯著能力，近年來，人們對弓形蟲卵囊的興趣與日俱增，因為其在弓形蟲傳播到新的宿主和生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，而且與海洋哺乳動物感染和人類水源性疫情有關(guān)。弓形蟲表現(xiàn)出高度的遺傳多樣性，包括具有不同毒力潛力的菌株。盡管近年來在了解不同基因型弓形蟲不同致病行為的分子基礎(chǔ)方面取得了重大進(jìn)展，但有關(guān)感染結(jié)局差異的機(jī)制尚不完全清楚。

之前的研究發(fā)現(xiàn)了三個弓形蟲克隆系，它們在小鼠中表現(xiàn)出不同的毒力表型，其中I型株對小鼠是致死的，而III型株和III型株的毒力較低。此外，卵囊孢子形成過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)變化已有相關(guān)報道，然而，對促進(jìn)不同基因型菌株毒力的差異表達(dá)蛋白的了解仍然有限。

● 研究結(jié)果

1. 蛋白質(zhì)的鑒定與表達(dá)

研究者通過iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了弓形蟲卵囊中強(qiáng)毒株P(guān)ys和弱毒株P(guān)RU之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，共鑒定出2551個蛋白(圖1)。兩個生物副本的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果如圖2所示，COG聚類分析將鑒定的蛋白質(zhì)分為26個類別。如圖3所示，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶；一般功能預(yù)測；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；以及能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換是識別最多的五類蛋白質(zhì)。通過比較Pys株和PRU株的相對蛋白質(zhì)表達(dá)值來鑒定差異蛋白。結(jié)果顯示共有374個蛋白質(zhì)被歸類為差異蛋白，其中192個蛋白質(zhì)增加，182個蛋白質(zhì)減少；GTP結(jié)合蛋白LEPA(TGME49_307980)、弓形蟲D家族蛋白(TGME49_271590)、TGME49_294600、TGME49_205090和毒物霉素(TGME49_214080)是增加最多的5個蛋白，相反，減少最多的5個蛋白分別是致密顆粒蛋白GRA7(TGME49_203310)、TGME49_203890、桿狀蛋白ROP5(TGME49_308090)、含鋅酒精脫氫酶(TGME49_311780)和紐迪克斯型基序9異構(gòu)體家族蛋白(TGME49_247220)。

  圖1

  圖2

  圖3

2. DEP的功能注釋                                                                                        

為了闡明Pys和PRU菌株卵囊中差異蛋白的生物學(xué)作用，研究者使用GOseq R軟件包進(jìn)行了GO富集分析。分析將差異增加和減少的GO蛋白分為生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三大類，這三個類別中最豐富的前10個GO術(shù)語分別針對增加和減少的蛋白質(zhì)(圖4A-4B)。生物過程中蛋白質(zhì)增加的前五個富集GO術(shù)語包括小分子代謝過程、細(xì)胞蛋白修飾過程、生物合成過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程和翻譯過程。相應(yīng)地，蛋白質(zhì)降低的前五個過程分別為細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程、生物合成過程、碳水化合物代謝過程。

圖4

細(xì)胞成分類別中增加的前三個術(shù)語包括細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合體，而減少的前三個術(shù)語包括胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞。在分子功能類別中，離子結(jié)合項是GO項最顯著富集的項。KEGG途徑富集分析顯示164個差異蛋白具有KEGG正畸(KO)ID，與51條途徑相關(guān)。圖5顯示了27條高度富集的途徑。其中最顯著富集的10條途徑是代謝途徑、次生代謝物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代謝、氨基酸的生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、過氧化物酶體、核糖體、丙酸代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解。

圖5

3. 毒力因子表達(dá)的差異

弓形蟲卵囊的許多毒力因子在孢子形成過程中增加，這與孢子化卵囊的感染性有關(guān)。本研究中，研究者檢測到了PYS和PRU菌株的孢子化卵囊之間這些毒力蛋白表達(dá)水平的差異。在PYS菌株和PRU菌株的孢子化卵囊中常見的22種毒力蛋白中，只有絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶2C（PP2C）和rhoptry蛋白ROP16（ROP16）在PRU菌株中具有更高的表達(dá)水平。相比之下，13種毒力因子包括GRA6，RON4，MIC3，ROP2A，GRA1，RON5，ROP18，MIC2，頂膜抗原AMA1，MIC4，MIC6，ROP5和GRA7在PYS菌株中上調(diào)。此外，ROM4，VP1，SPA-TR，MIC1，PHIL1，MIC8和RON2等七種毒力蛋白的表達(dá)水平在兩種菌株之間沒有顯示出任何顯著差異（圖6）。這些結(jié)果表明，毒性PYS菌株的孢子化卵囊比毒性較低的PRU菌株的孢子化卵囊表達(dá)更多的毒力因子。

圖6

4. 卵囊壁蛋白的表達(dá)

卵囊壁蛋白在弓形蟲卵囊的環(huán)境耐受性中起著重要的作用，可以保護(hù)子孢子免受外界環(huán)境和宿主內(nèi)部不利條件的影響。研究者鑒定了22個卵囊壁蛋白，并分析了它們在弓形蟲卵囊兩個不同基因型變異體之間的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，卵囊壁蛋白增加了10個，減少了3個。大約一半的卵囊壁蛋白在PRU卵囊中的表達(dá)水平高于Pys卵囊。與PRU卵囊相比，Pys卵囊中只有3種卵囊壁蛋白過表達(dá)。其他9種卵囊蛋白在兩株寄生蟲之間無顯著差異。這些卵囊壁蛋白表達(dá)的差異可能與Pys品系和PRU品系卵囊在環(huán)境中生存能力的差異有關(guān)。

5. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

研究者使用Cytoscape軟件構(gòu)建差異蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)(圖7)。相互作用的程度被定義為確定一個節(jié)點(diǎn)與之直接相連的鄰居的數(shù)量，與其他蛋白質(zhì)高度相互作用的節(jié)點(diǎn)被定義為“HUB”蛋白。其中重要的HUB蛋白是肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)、GMP合成酶、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(G6PD)和檸檬酸合成酶(CS)。這些蛋白都在各種代謝過程中起著重要作用。例如，IMPDH和GMP合成酶是合成鳥嘌呤核苷酸的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是很好的治療靶點(diǎn)；同樣，G6PD和線粒體CS在糖酵解和碳水化合物代謝中起作用。這四種HUB蛋白的qPCR驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)一致(圖8)。Pys品系的G6PD和GMP表達(dá)水平低于PRU品系，IMPDH和CS表達(dá)水平高于PRU品系。

圖7

圖8