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中文標(biāo)題：磷脂過氧化驅(qū)動(dòng)的軟骨生成轉(zhuǎn)錄因子修飾介導(dǎo)了烷氧基誘導(dǎo)的胚胎骨發(fā)育損傷

發(fā)表期刊：Redox Biology

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：10.787

發(fā)表時(shí)間：2022年8月

合作單位：暨南大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

產(chǎn)前母親壓力與分娩不良有關(guān)，比如早產(chǎn)、嬰兒死亡率高或出生體重低等。母體壓力引起的胚胎骨發(fā)育不良是一種典型的發(fā)育障礙，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的，但其具體機(jī)制尚不明確。子宮發(fā)生內(nèi)源性氧化還原反應(yīng)或受到外源刺激都會(huì)形成各種自由基（如烷氧基自由基）并傳遞給胚胎，使胚胎受到氧化損傷。2,2′-偶氮雙[2-甲基丙脒]二鹽化物(AAPH)是一種經(jīng)典的烷氧基自由基生成物，被廣泛應(yīng)用于氧化應(yīng)激相關(guān)的研究，本項(xiàng)目利用AAPH深入探討了烷氧基自由基誘導(dǎo)雞胚胎骨發(fā)育缺陷的確切機(jī)制。

● 研究結(jié)果

1. 烷氧基自由基會(huì)延緩胚胎骨骼發(fā)育

首先，研究人員通過注射AAPH建立雞胚胎慢性氧化應(yīng)激模型：在胚胎發(fā)育第1.5天開始注射，之后每隔一天注射一次，共注射5次（圖1A）。胚胎發(fā)育第17天時(shí)，AAPH處理的胚胎死亡率顯著升高（圖1B）、胚胎重量減少（圖1C）、肢體生長(zhǎng)遲緩（圖1D）。為了確定在軟骨內(nèi)骨形成過程中是否已經(jīng)發(fā)生肢體畸形，對(duì)胚胎發(fā)育第7天的胚胎軟骨進(jìn)行染色，結(jié)果與第17天一致，都呈現(xiàn)較短的肢體（圖1E）。軟骨內(nèi)骨化是胎兒早期肢體發(fā)育的關(guān)鍵步驟，可分為停滯區(qū)、增殖區(qū)（PZ）、肥大區(qū)和鈣化區(qū)（圖1F）。對(duì)脛骨生長(zhǎng)板的石蠟切片進(jìn)行H&E染色（圖1G），發(fā)現(xiàn)AAPH處理導(dǎo)致PZ的結(jié)構(gòu)被破壞、長(zhǎng)度縮短（圖1H）。這些結(jié)果表明烷氧基自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了軟骨發(fā)育異常，從而阻礙了胚胎骨生長(zhǎng)。

  圖1

2. 鐵下垂與烷氧基自由基誘導(dǎo)的軟骨發(fā)育缺陷有關(guān)

為了確定氧化應(yīng)激誘導(dǎo)異常軟骨發(fā)生的分子機(jī)制，研究人員對(duì)AAPH處理和對(duì)照的雞胚軟骨組織進(jìn)行了iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖2A），共鑒定出1534種可信蛋白質(zhì)（置信度≥95%），其中16種蛋白質(zhì)上調(diào)，2種蛋白質(zhì)下調(diào)（圖2B）。此外，富集分析顯示，差異表達(dá)蛋白富集在鐵離子結(jié)合途徑中（圖2C）；KEGG分析表明，差異蛋白富集在鐵下垂途徑、花生四烯酸代謝、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控途徑等（圖2D和E）。之后，western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了與鐵下垂相關(guān)的關(guān)鍵差異蛋白（圖2F），其中DMT1和TFR1蛋白在AAPH組表達(dá)升高，GPX4和SLC7A11蛋白在AAPH組表達(dá)降低（圖2G）。此外，AAPH處理還可促進(jìn)MDA產(chǎn)生和GSH消耗（圖2H和I），并顯著降低骨組織中GPX和SOD的活性（圖2J和K）。用鐵下垂誘導(dǎo)劑RSL3處理雞胚，當(dāng)劑量在1.0至10.0 nM之間時(shí)，胚胎死亡率顯著增加（圖2L），胚胎重量顯著降低（圖2M）。阿爾西安藍(lán)染色表明RSL3處理顯著抑制了胚胎肢體的生長(zhǎng)（圖2N）。這些結(jié)果說明，鐵下垂在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的骨發(fā)育障礙中起重要作用。

圖2

3. 鐵下垂抑制劑減輕了烷氧基自由基誘導(dǎo)的軟骨發(fā)育缺陷

為了證實(shí)鐵下垂在異常骨發(fā)育中的作用，在體內(nèi)使用了Fer-1和DFO。Fer-1減輕了胚胎發(fā)育第17天AAPH處理組的雞胚死亡率上升（圖4A）和重量下降（圖4B）；Fer-1也能減弱AAPH對(duì)脛骨生長(zhǎng)的抑制（圖4C和D）。H&E染色顯示，F(xiàn)er-1處理恢復(fù)了發(fā)育的骨骼中脛骨PZ的收縮（圖4E和F）。DFO處理的雞胚也觀察到類似趨勢(shì)。與發(fā)育第17天一樣，AAPH處理也加重了發(fā)育第7天的胚胎死亡率和重量下降（圖4G和H）。DFO顯著緩解了AAPH引起的脛骨縮短（圖4I和J）。

圖3

4. 烷氧基自由基會(huì)引發(fā)軟骨細(xì)胞鐵過載

鐵是芬頓反應(yīng)傳播磷脂過氧化所必需的。DMT1和TFR1是兩種主要的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有助于細(xì)胞中的鐵代謝。對(duì)DMT1和TFR1表達(dá)水平的ITAQ檢測(cè)（圖2A）和WB檢測(cè)（圖2G）說明鐵參與了烷氧基自由基阻礙軟骨形成的過程。接下來，研究人員檢測(cè)了軟骨細(xì)胞中鐵的變化。AAPH/RSL3處理的細(xì)胞中Fe2+水平較高，F(xiàn)er-1和DFO處理會(huì)降低Fe2+水平（圖5A-C）。為了進(jìn)一步了解鐵在軟骨形成中的作用，用siRNA干擾鐵下垂相關(guān)蛋白DMT1的表達(dá)（圖5D），這逆轉(zhuǎn)了AAPH對(duì)成骨相關(guān)基因BMP6、COL2A1和ACAN的抑制作用（圖5E）。以上體外研究結(jié)果說明，鐵過載在氧化應(yīng)激干擾胚胎成骨過程中起關(guān)鍵作用。

圖4

5. 富含烷氧基自由基的軟骨細(xì)胞中，氧化磷脂（OxPL）的積累抑制軟骨生成

磷脂雙烯丙基位置的PUFA氧化是過氧化和鐵下垂的驅(qū)動(dòng)因素，研究人員利用C11-BODIPY染色測(cè)量了脂質(zhì)過氧化水平（圖6A），結(jié)果顯示AAPH或Erastin處理導(dǎo)致了細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累，而Fer-1處理抑制了脂質(zhì)過氧化。通過氧化還原脂質(zhì)組學(xué)分析確定了五大類氧化磷脂（OxPL）：磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂?；z氨酸（PS）、磷脂基甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI）（圖6B）。與對(duì)照組相比，AAPH組表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)過氧化模式（圖6C），單氧化和二氧化磷脂種類大量增加（圖6D和E）。1-硬脂酰-2-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺（SAPE-OOH）能否直接促進(jìn)骨骼發(fā)育呢？用外源性SAPE-OOH處理ATDC5細(xì)胞后，Bmp6、Co12a1和Acan等骨發(fā)育有關(guān)基因的表達(dá)被抑制（圖6F）。這些結(jié)果說明富含烷氧基自由基的軟骨細(xì)胞中的OxPL積累，抑制了軟骨形成過程。

圖5

圖6

6. 4-HNE修飾驅(qū)動(dòng)了SOX9蛋白的泛素依賴性降解

轉(zhuǎn)錄因子SOX9是軟骨發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。結(jié)果顯示，AAPH處理降低了SOX9蛋白水平而非mRNA水平（圖7A和B），也嚴(yán)重干擾了軟骨發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，DFO處理能逆轉(zhuǎn)這些變化（圖7C）。4-HNE是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，能夠與多種蛋白質(zhì)反應(yīng)形成HNE蛋白質(zhì)加合物，改變其活性或誘導(dǎo)其降解。研究者發(fā)現(xiàn)4-HNE結(jié)合蛋白水平在AAPH處理后顯著增加（圖7D）。那么SOX9蛋白的下調(diào)是否與4-HNE修飾相關(guān)？Co-IP結(jié)果表明，AAPH處理導(dǎo)致與4-HNE結(jié)合的SOX9增多（圖7E）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了4-HNE和SOX9的共定位（圖7F）。正如預(yù)期，DMT1干擾削弱了SOX9與4-HNE的結(jié)合（圖7G）。CHX實(shí)驗(yàn)表明，外源4-HNE處理顯著促進(jìn)了SOX9蛋白的降解（圖7H），但蛋白酶體抑制劑MG132抑制了AAPH導(dǎo)致的SOX9蛋白水平下降，自噬抑制劑3-MA幾乎沒有作用（圖7I）。用泛素和SOX9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SW1353細(xì)胞，AAPH處理促進(jìn)了SOX9的K48泛素化，DMT1-siRNA逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果（圖7J和K）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在軟骨細(xì)胞中，脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物4-HNE通過蛋白質(zhì)修飾來調(diào)節(jié)SOX9的泛素-蛋白酶體降解。

圖7

●   總結(jié)

本研究證明了烷氧基自由基誘導(dǎo)產(chǎn)前骨生長(zhǎng)遲緩和軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路：烷氧基自由基通過胚胎中鐵介導(dǎo)的芬頓反應(yīng)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中氧化磷脂的顯著積累，此外脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物4-HNE的作用，它與關(guān)鍵的軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子SOX9形成加合物，導(dǎo)致其降解，從而抑制軟骨形成。

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