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乙型肝炎病毒激活癌胎基因SALL4在PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞耗竭中抵消miR-200c

發(fā)表期刊：Nature Communication

影響因子：17.694

發(fā)表時(shí)間：2018年9月

合作單位：中國科學(xué)院先天免疫與慢性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

運(yùn)用技術(shù)：shRNA慢病毒載體構(gòu)建（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

慢病毒感染和腫瘤微環(huán)境可促使浸潤的病毒特異性或腫瘤特異性T細(xì)胞衰竭，從而嚴(yán)重?fù)p害這些細(xì)胞的增殖能力和效應(yīng)功能，使免疫反應(yīng)無法消除病毒或排斥腫瘤。其中，肝臟病毒感染是促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)展和進(jìn)展的主要因素。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)HCC病例是HBV或丙型肝炎病毒持續(xù)感染的結(jié)果。CD8+T細(xì)胞的激活不僅通過識(shí)別感染肝細(xì)胞表面呈現(xiàn)的表位來調(diào)節(jié)，還通過T細(xì)胞表面的共抑制和共刺激分子、包括肝細(xì)胞在內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的配體相互作用介導(dǎo)的正負(fù)信號(hào)之間的平衡來調(diào)節(jié)。臨床資料表明，PD-1/PD-L1的表達(dá)與肝癌患者的腫瘤大小、血管浸潤和腫瘤分期呈正相關(guān)。然而迄今為止，HBV感染如何誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，宿主因素是否控制了HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)，以及潛在的相互作用機(jī)制等仍然不清楚。

MicroRNAs(MiRNA)通過指導(dǎo)mRNA翻譯的降解或抑制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平的降低。其被認(rèn)為是HBV相關(guān)HCC預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，miR141和miR-200家族在HCC膽管腫瘤血栓患者中下調(diào)，并作為無病生存的獨(dú)立預(yù)測因子。然而，MiRNA是否參與了PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)，HBV是否與MiRNA有內(nèi)在的抵消，以及它們之間的相互作用如何影響抗HBV免疫，都還需要進(jìn)一步研究。Sal樣蛋白4 (Sall4)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新14，15。SALL4作為一種在許多人類癌癥中表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)與侵襲性HCC和不良預(yù)后相關(guān)。然而，HBV是否具有激活成人肝臟中SALL4表達(dá)的功能，以及SALL4和miRNA是否相互作用以調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)仍不清楚。

● 研究結(jié)果

1.肝癌組織中SALL4和PD-L1與miR-200c呈負(fù)相關(guān)

科學(xué)界已經(jīng)認(rèn)識(shí)到PD-L1在多種惡性腫瘤中的作用，在微陣列分析中，miR-200c被報(bào)道為HCC的miRNA指示物之一，SALL4在HCC中高表達(dá)且預(yù)后不良。分析顯示，miR-200c直接靶向PD-L1的3‘-UTR；另一方面，轉(zhuǎn)錄因子SALL家族調(diào)控miR-200c在miR-200c啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的三個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)(圖1A)。免疫組織化學(xué)分析(圖1B)結(jié)果顯示98例肝癌患者腫瘤組織中PD-L1和SALL4在瘤周和瘤中心的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌中心區(qū)SALL4和PD-L1的表達(dá)均顯著增高(圖1C，D)。原位雜交顯示腫瘤中心miR-200c的表達(dá)密度顯著高于瘤周(圖1E)。值得注意的是，雖然SALL4、PD-L1和miR200c的表達(dá)均有顯著增加，但這三個(gè)分子的差異極大，與腫瘤中心區(qū)域相比，SALL4和PD-L1的表達(dá)明顯升高，而miR-200c的表達(dá)相對(duì)較低，而SALL4和PD-L1的表達(dá)是平行的(圖1F)，提示在HCC進(jìn)展過程中SALL4、miR-200c和PD-L1之間可能存在密切的關(guān)系。

圖1

研究者分析了每個(gè)HCC患者腫瘤中心區(qū)域SALL4、miR-200c和PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系，在3例有代表性的患者中，miR-200c的低表達(dá)明顯伴隨著SALL4或PD-L1的高密度，而miR-200c的高表達(dá)使SALL4或PD-L1的密度保持較低(圖2A)，導(dǎo)致SALL4和miR-200c或miR-200c和PD-L1之間存在高度顯著的兩對(duì)負(fù)相關(guān)，同時(shí)SALL4和PD-L1表達(dá)之間存在正相關(guān)（圖2B）；而在瘤周區(qū)域，這些分子之間不具有統(tǒng)計(jì)相關(guān)性（圖2C，D)。接下來，研究者利用QRT-PCR技術(shù)檢測了8例新鮮肝癌組織中miR-200c的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-200c的表達(dá)與SALL4或PD-L1的積分光密度(IOD)/面積呈負(fù)相關(guān)(圖2E)。研究者進(jìn)一步檢測了可能靶向PD-L1的miR-200A和miR-383的表達(dá)，并分析了它們與肝癌患者SALL4和PD-L1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)了miR-200c與SALL4或PD-L1相互作用的特異性。

圖2

2. SALL4和miR-200c與總生存期相關(guān)

研究者對(duì)SALL4和miR-200c在腫瘤中心區(qū)域的潛在預(yù)后價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，PD-L1(積分光密度/面積)與腫瘤中心的總生存率（OS）呈負(fù)相關(guān)(圖3A)，而在瘤周無相關(guān)性(圖3B)；腫瘤中心區(qū)域PD-L1的高表達(dá)與肝癌患者較短的OS顯著相關(guān)(圖3C)。在同一HCC組中，miR-200c的表達(dá)與OS在腫瘤中心和瘤周中也存在正相關(guān)(圖3D，E)，且miR-200c密度越高，OS預(yù)后越好(圖3F)。此外，與PD-L1相似，腫瘤中心區(qū)域SALL4的表達(dá)與OS呈負(fù)相關(guān)(圖3G)，而與瘤周區(qū)域無相關(guān)性(圖3H)，表明腫瘤中心區(qū)域SALL4高表達(dá)的患者OS較短(圖3I)。此外，綜合分析顯示，SALL4降低而miR-200c升高(圖3J)、SALL4降低而PD-L1降低(圖3K)、PD-L1降低而miR-200c升高(圖3L)的患者的OS顯著延長。這些發(fā)現(xiàn)證明了SALL4或miR-200c在腫瘤中心區(qū)域的預(yù)后價(jià)值，可能成為一項(xiàng)有前途的肝癌生存預(yù)測指標(biāo)。

圖3

3. miR-200c下調(diào)HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)

HBV慢性感染是肝癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，為研究其潛在機(jī)制，研究者檢測了HBV +HLCZ01細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c、miR-200a和miR-383的模擬物或抑制劑后PD-L1的表達(dá)，這些模擬物或抑制劑在HBV+HLCZ01細(xì)胞中均減少，并且有可能靶向PD-L1的3?-UTR（圖1A）。miR-200c模擬物顯著降低PD-L1表達(dá)，miR-200c抑制劑顯著增強(qiáng)PD-L1表達(dá)，而miR-200a和miR-383模擬物則對(duì)PD-L1水平無顯著影響（圖4A）。miR-200c模擬物和抑制劑對(duì)PD-L1表達(dá)的影響是劑量依賴性的（圖4B）。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-200c直接靶向PD-L1的3?-UTR，研究者進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，miR-200c模擬物顯著降低熒光素酶活性，而miR-200c抑制劑顯著增強(qiáng)熒光素酶活性。這些結(jié)果表明，miR-200c直接靶向PD-L1的3?-UTR。

圖4

為了探討miR-200c是否能拮抗HBV，從而影響PD-L1的表達(dá)，研究者用HBV感染細(xì)胞，并檢測miR-200c的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)受到顯著抑制（圖4D），表明HBV抑制了miR-200c的表達(dá)。研究者還將miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染到HBV +HLCZ01細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-200c幾乎完全消除了HBV介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)上調(diào)（圖4E），表明miR-200c阻礙HBV介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)。使用HepaRG細(xì)胞系的另一個(gè)體外HBV感染模型也獲得了類似的結(jié)果（圖4F）。研究者構(gòu)建了一個(gè)miR-200c過表達(dá)載體，將其注射到HBV持續(xù)感染的小鼠體內(nèi)。正如預(yù)期的那樣，HBV +小鼠中的miR-200c表達(dá)水平顯著低于HBV -小鼠(圖4G)。相反，miR-200c過表達(dá)顯著減弱HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞PD-L1表達(dá)上調(diào)(圖4H)。這些結(jié)果表明，HBV和miR-200c在HBV感染的肝細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)過程中存在拮抗作用。

4. miR-200c逆轉(zhuǎn)HBV陽性小鼠CD8+T細(xì)胞耗竭

肝細(xì)胞中PD-L1的升高導(dǎo)致了HBV持續(xù)感染小鼠中CD8+T細(xì)胞的耗竭。研究者進(jìn)一步探討了miR-200c在HBV誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞耗竭中的作用，結(jié)果顯示，在小鼠肝臟特異性miR-200c過表達(dá)后，小鼠肝臟CD69+CD8+、干擾素-γ+CD8+和CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比和對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用顯著增加，接近了PD-L1阻斷所達(dá)到的水平（圖5A-G）。miR-200c過表達(dá)小鼠的肝淋巴細(xì)胞含有更多的HBc特異性CD8+T細(xì)胞(圖5I)、HBc特異性干擾素-γ+CD8+T細(xì)胞(圖5J)和HBc特異性記憶CD8+T細(xì)胞(圖5K)，表明miR-200c過表達(dá)的小鼠肝淋巴細(xì)胞含有更多的HBc特異性CD8+T細(xì)胞(圖5I)，特別是更多的HBc特異性干擾素-CD8+CD8+T細(xì)胞(圖5J)和更多的HBc特異性記憶CD8+T細(xì)胞。

圖5

5. HBV通過STAT3誘導(dǎo)SALL4下調(diào)miR-200c

通過比較HBV +和HBV -肝癌細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平，研究者發(fā)現(xiàn)HBV促進(jìn)了STAT3的激活(圖6A)。進(jìn)一步做DNA序列分析，-1.5-kb SALL4啟動(dòng)子區(qū)域顯示了四個(gè)與STAT3結(jié)合的共同序列(圖6B)。用STAT3抑制劑WP1006處理HBV誘導(dǎo)的HLCZ01和HepaRG細(xì)胞，然后檢測SALL4蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示STAT3抑制劑WP1006顯著降低了HBV誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞中SALL4的表達(dá)(圖6C)。為了證實(shí)STAT3在SALL4表達(dá)調(diào)控中的作用，研究者構(gòu)建了含有SALL4啟動(dòng)子或突變啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體。用報(bào)告載體轉(zhuǎn)染HLCZ01細(xì)胞，同時(shí)用STAT3激活的細(xì)胞因子IL-6處理HLCZ01細(xì)胞，結(jié)果顯示，IL-6刺激可顯著增強(qiáng)SALL4野生型啟動(dòng)子的活性，而不是突變啟動(dòng)子的活性，這可能是通過激活STAT3來實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)閃P1006抑制STAT3的激活會(huì)顯著降低SALL4啟動(dòng)子的熒光素酶活性(圖6D)。通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)，研究者還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性STAT3可以直接與SALL4的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合(圖6E），表明HBV的持續(xù)可能通過STAT3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子SALL4下調(diào)miR-200c。正如預(yù)期的那樣，WP1006處理顯著降低了HBV+HLCZ01細(xì)胞在基因和蛋白水平上PD-L1的表達(dá)(圖6F-G)。

圖6

接下來，研究者試圖研究SALL4是如何調(diào)控miR-200c轉(zhuǎn)錄的。生物信息學(xué)分析顯示，miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)有三個(gè)推測的SALL家族結(jié)合位點(diǎn)(圖1A)。HBV感染顯著促進(jìn)了HLCZ01細(xì)胞SALL家族，尤其是SALL4在mRNA(上調(diào))和蛋白(下調(diào))水平的表達(dá)(圖7A)。進(jìn)一步分析顯示，沉默SALL4顯著增強(qiáng)miR-200c的表達(dá)，并導(dǎo)致HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)降低，而SALL4的過表達(dá)顯著降低miR-200c的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)(圖7D,E)，HBV+HepaRG細(xì)胞中的結(jié)果也是類似的(圖7F-H)。后續(xù)的熒光素酶報(bào)告和ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SALL4抑制了miR-200c的啟動(dòng)子活性(圖7I)，并能直接與miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合(圖7J)。這些結(jié)果清楚地表明，HBV的持續(xù)促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄抑制因子SALL4的表達(dá)，SALL4又通過與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合直接抑制miR-200c的表達(dá)。

圖7

6. 沉默Sall4阻礙HBV復(fù)制和CTL耗盡

為了進(jìn)一步證實(shí)SALL4在體內(nèi)促進(jìn)HBV持續(xù)存在和HCC進(jìn)展中的作用，研究者沉默SALL4基因，以觀察其對(duì)HBV持續(xù)存在小鼠中HBV感染或持續(xù)的影響(圖8A，B)。與HBV?小鼠相比，持續(xù)感染HBV的小鼠SALL4和PD-L1的表達(dá)較高，miR-200c的轉(zhuǎn)錄較低，而沉默SALL4則顯著增強(qiáng)miR-200c的轉(zhuǎn)錄并降低PD-L1的表達(dá)(圖8C，D)。此外，沉默Sall4顯著增加干擾素-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比，降低CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，抑制CD8+T細(xì)胞的凋亡(圖8E)，同時(shí)降低乙肝病毒持續(xù)存在小鼠的HBsAg和HBeAg水平(圖8F)。

圖8

研究進(jìn)一步證實(shí)，在HBV+HCC患者中，肝癌細(xì)胞中SALL4的重新激活與CD8+T細(xì)胞耗竭有關(guān)。研究者采用免疫熒光染色法檢測新鮮肝癌患者瘤周和瘤中心的SALL4表達(dá)、PD-1表達(dá)和CD8+T細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果顯示，SALL4在腫瘤中心區(qū)域的表達(dá)明顯高于瘤周區(qū)域，SALL4在中心腫瘤區(qū)域的表達(dá)遠(yuǎn)高于腫瘤周圍區(qū)域，而腫瘤中心區(qū)域的腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞含量遠(yuǎn)低于腫瘤周圍區(qū)域（圖9A）；不過盡管腫瘤中心區(qū)域的腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞總數(shù)量減少，中心腫瘤區(qū)域的PD-1+CD8+T細(xì)胞含量是遠(yuǎn)高于瘤周區(qū)域的（圖9A）。此外，統(tǒng)計(jì)分析表明，SALL4表達(dá)與腫瘤浸潤性PD-1+CD8+T細(xì)胞之間存在正相關(guān)（圖9B），這增加了肝細(xì)胞SALL4在HBV+HCC進(jìn)展過程中通過表達(dá)PD-L1參與PD-1+CD8+T細(xì)胞衰竭的可能性。

圖9