中文標(biāo)題：固醇通過APMAP抑制EGFR降解誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

發(fā)表期刊：Cancer Research

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：13.312

發(fā)表時(shí)間：2019年4月

合作單位：中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所

運(yùn)用技術(shù)：Co-IP-MS/MS，生物信息學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看詳情）

● 研究背景

相比于局限性前列腺癌，轉(zhuǎn)移性前列腺癌無疑是致命的。近來已有報(bào)道表明，膽固醇與前列腺癌的發(fā)展有關(guān)，并可能成為前列腺癌的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。脂肪細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白(APMAP)是一種跨膜蛋白，在脂肪細(xì)胞分化和肥胖過程中被特異性誘導(dǎo)，EGFR底物15相關(guān)蛋白(EPS15R)被報(bào)道可調(diào)節(jié)EGFR的內(nèi)化。了解膽固醇在前列腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及具體機(jī)制，才能夠?yàn)榍傲邢侔┑闹委熖峁┬碌牟呗浴?/span>

● 研究結(jié)果

1. 膽固醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生依賴于ERK1/2的激活

研究者分別對(duì)加膽固醇和不加膽固醇處理的前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行了EMT標(biāo)志物檢測，結(jié)果顯示膽固醇處理增加了EMT標(biāo)志物的遷移、侵襲和表達(dá)（圖1A-D）。通過對(duì)幾種調(diào)控EMT的信號(hào)通路的檢測以及后續(xù)的ERK1/2抑制劑實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膽固醇治療下增加的細(xì)胞遷移和侵襲在兩種ERK抑制劑治療后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這表明ERK信號(hào)通路在膽固醇誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞EMT中是必不可少的（圖1E-H）。

圖1

2. 膽固醇促進(jìn)EGFR和APMAP在脂筏中的積聚

研究者對(duì)膽固醇處理下的差異表達(dá)基因進(jìn)行了進(jìn)一步的GO分析和通路分析，結(jié)果顯示，這些基因聚集在EGFR、WNT和VEGF信號(hào)通路中，這些信號(hào)通路都與EMT，此外，GO分析表明膽固醇可能參與了膜筏相關(guān)的過程（圖2A-B）。LC-MS/MS分析膽固醇處理前后PC-3細(xì)胞脂筏蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)ERK1/2的上游調(diào)節(jié)因子EGFR和結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的APMAP在膽固醇處理后的脂筏中均有增加(圖2D)。為進(jìn)一步確定APMAP是否參與EGFR的積聚，將EGFR-RFP載體轉(zhuǎn)染至APMAP缺失的PC-3細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，然后用膽固醇處理。在對(duì)照細(xì)胞中，膽固醇增強(qiáng)了EGFR-RFP的熒光；然而當(dāng)APMAP被敲除后，膽固醇對(duì)EGFR的影響幾乎完全被抑制(圖2F)。同時(shí)，APMAP的敲除削弱了EGFR的積累，從而降低了膽固醇誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化(圖2G)。這些數(shù)據(jù)表明，APMAP增加了前列腺癌細(xì)胞中由膽固醇誘導(dǎo)的EGFR的蛋白水平。

圖2

3. APMAP通過EGFR促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT

接下來，研究者對(duì)APMAP基因敲除后的差異表達(dá)基因進(jìn)行了進(jìn)一步的GO分析和KEGG通路分析，這些基因與類固醇生物合成和膽固醇代謝過程聚集在一起(圖3A)，這表明APMAP和膽固醇可能有重疊的功能。APMAP基因敲除顯著抑制了膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲能力和EMT過程(圖3B-D)。相反，APMAP的過表達(dá)促進(jìn)了遷移和侵襲，而EGFR抑制劑則抑制了這一效應(yīng)(圖3E，F(xiàn))。此外，EGFR抑制劑顯著抑制了ERK1/2的激活，并抑制了APMAP過表達(dá)細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)(圖3G)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之類似，與對(duì)照組相比，注射膽固醇組的細(xì)胞明顯形成更多的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。膽固醇組的轉(zhuǎn)移瘤組織中，EGFR mRNA、APMAP和Vimentin的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，APMAP基因敲除顯著降低了它們的表達(dá)水平(圖3J，K)。這些數(shù)據(jù)表明APMAP通過調(diào)節(jié)EGFR參與膽固醇誘導(dǎo)的EMT過程。

圖3

4. 膽固醇通過APMAP降低EGFR的內(nèi)化

qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)膽固醇對(duì)EGFR的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響(圖4A)，這說明APMAP對(duì)EGFR水平的調(diào)節(jié)發(fā)生在翻譯之后。EGFR的降解依賴于內(nèi)化，研究者推測膽固醇對(duì)EGFR降解的抑制是通過EGFR的內(nèi)化實(shí)現(xiàn)的。共聚焦顯微鏡顯示，在膽固醇處理下，EGFR和早期內(nèi)體標(biāo)記Rab5在兩個(gè)細(xì)胞中的共存減少（圖4D，E）；APMAP-G FP與Rab5-RFP的共存增加(圖4F)。轉(zhuǎn)染EGFR-GFP/Rab5-RFP和APMAP-GFP/Rab5-RFP至PC-3細(xì)胞，膽固醇處理后，APMAP沉默的細(xì)胞中EGFR與Rab5的共存增加(圖4G)。這些數(shù)據(jù)表明，APMAP調(diào)節(jié)膽固醇介導(dǎo)的EGFR的穩(wěn)定性。

圖4

5. APMAP通過與EPS15R相互作用抑制EGFR內(nèi)化

使用Co-IP和LC/MS-MS分析來確定APMAP的結(jié)合伙伴，對(duì)檢測到的APMAP結(jié)合蛋白進(jìn)行了GO富集和途徑分析，數(shù)據(jù)表明APMAP參與了囊泡的輸注和囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于EPS15R參與EGFR的內(nèi)化，研究者首先通過Co-IP證實(shí)了內(nèi)源性APMAP與EPS15R的相互作用(圖5C)，發(fā)現(xiàn)EPS15R的蛋白水平不受膽固醇的影響(圖5D)，且質(zhì)膜免疫熒光顯示，這種相互作用通過膽固醇治療得到加強(qiáng)(圖5F)，并與EGFR解離(圖5G)。根據(jù)這些結(jié)果，研究者推測EPS15R在APMAP介導(dǎo)的EGFR降解中起關(guān)鍵作用。為驗(yàn)證假設(shè)，研究者進(jìn)行了APMAP沉默和/或EPS15R沉默的膽固醇處理的DU145細(xì)胞中EGFR和Rab5的免疫染色，結(jié)果顯示，APMAP沉默促進(jìn)EGFR向早期內(nèi)體募集的作用被EPS15R的沉默)所阻斷(圖5H)。在有膽固醇存在的APMAP耗竭沉默的細(xì)胞中，EGFR的蛋白水平因EPS15R的耗竭而恢復(fù)(圖5I)。這些結(jié)果表明，APMAP通過與EPS15R結(jié)合，抑制EGFR內(nèi)化到早期內(nèi)小體，從而影響膽固醇誘導(dǎo)的EGFR蛋白穩(wěn)定性。

圖5

6. APMAP在前列腺癌中顯著上調(diào)

為了了解APMAP在惡性腫瘤中的作用，研究者對(duì)15種癌癥中APMAP的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中APMAP的表達(dá)均顯著高于鄰近正常組織(圖6B)。ROC曲線分析顯示APMAP表達(dá)在預(yù)測前列腺癌組織與正常組織的敏感性和特異性(圖6C)。為探討APMAP在前列腺癌組織和正常組織中的表達(dá)情況，對(duì)80例前列腺癌患者和8例正常對(duì)照的組織芯片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示與正常組織相比，前列腺癌組織中APMAP蛋白的表達(dá)增加(圖6D)。APMAP在腫瘤中的表達(dá)明顯增高,說明APMAP可作為前列腺癌的潛在診斷標(biāo)記物。

         圖6

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