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NCoR/SMRT共抑制子與c-MYC合作為體細(xì)胞重編程創(chuàng)造表觀遺傳屏障

發(fā)表期刊：Nature Cell Biology

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：28.213

發(fā)表時(shí)間：2018年

合作單位：中國(guó)科學(xué)院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

運(yùn)用技術(shù)：免疫共沉淀（Co-IP）MS（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

強(qiáng)制性表達(dá)已定義的外源因子（最初是OCT4，SOX2，KLF4和c-MYC（OSKM）可將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSC)。在重編程開(kāi)始時(shí)，外源OSKM與整個(gè)基因組的DNA結(jié)合，并誘導(dǎo)連續(xù)幾輪染色質(zhì)重組，從而激活整個(gè)多能性基因網(wǎng)絡(luò)。然而，OSKM不是孤立運(yùn)作的，需要共同的調(diào)節(jié)者來(lái)改變局部的表觀遺傳環(huán)境。盡管有關(guān)重編程中的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳反應(yīng)的研究越來(lái)越多，但有關(guān)OSKM和不同的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子(共激活因子和共抑制因子)如何相互作用或拮抗以誘導(dǎo)多能狀態(tài)目前仍知之甚少。

● 研究結(jié)果

1. NCoR/SMRT共抑制子為OSKM重新編程設(shè)置了障礙

首先，研究者檢測(cè)了NCOR1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和OSKM重編程細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，這兩種共抑制因子在三種細(xì)胞類(lèi)型中都有表達(dá)。接下來(lái)，研究者敲除了用OSKM逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的OG2 MEF中的NCOR1/2，結(jié)果顯示敲除任何一個(gè)共抑制子都能顯著增加Oct4綠色熒光蛋白陽(yáng)性(Oct4-GFP+)集落的數(shù)量(圖1A，B)，而且集落出現(xiàn)得更快(圖1C)。抑制NCOR1/2增強(qiáng)了使用不同介質(zhì)(包括高效率介質(zhì))的OSKM的重新編程，而與轉(zhuǎn)導(dǎo)方法、報(bào)告系統(tǒng)或MEF的類(lèi)型無(wú)關(guān)。為了解NCoR和SMRT是如何阻止重編程的，研究者在OSKM重編程的第5天和第9天對(duì)血清+VC中的NCOR1/2耗盡細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq(圖1E)，兩種基因敲除中差異表達(dá)的基因相似(圖1E)，但Ncor2基因敲除的整體效應(yīng)更強(qiáng)(圖1E)。NCOR1/2敲除后，許多富含MEF的體細(xì)胞基因在第5天被上調(diào)，在第9天變得不明顯(圖1F)，而與間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有受到影響。在第9天時(shí)，還出現(xiàn)了多能相關(guān)基因的上調(diào)。這些結(jié)果表明，在OSKM重編程中敲除NCOR1/2首先導(dǎo)致體細(xì)胞基因抑制的暫時(shí)性缺陷，然后加速和更有效地激活多能性基因。

圖1

2. NCoR/SMRT共抑制器需要HDAC3來(lái)破壞重新編程

NCoR和SMRT作為連接轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾因子的對(duì)接平臺(tái)來(lái)調(diào)節(jié)染色質(zhì)，包括不同的組蛋白脫乙酰酶(HDAC)家族成員。HDAC是調(diào)節(jié)NCoR/SMRT對(duì)OSKM重編程的有害影響的良好候選者，因?yàn)榉篐DAC抑制劑如丙戊酸(VPA)或曲古菌素(TSA)可促進(jìn)重編程。研究者觀察了HDAC1到HDAC11在MEF、ESC和OSKM介導(dǎo)的重編程過(guò)程中的表達(dá)。HDAC8、9、10和11在這三種細(xì)胞類(lèi)型中都不表達(dá)，而HDAC7只在MEF和重編程期間表達(dá)，在ESC中表達(dá)下調(diào)，HDAC1到HDAC6在三種細(xì)胞類(lèi)型中都有表達(dá)(圖2A)。接下來(lái)，研究者敲除了OSKM重編程中HDAC的表達(dá)(圖2B)，HDAC3敲除顯著增加了重新編程，而在其他HDAC中，只有HDAC2敲除可以增強(qiáng)重新編程(圖2B)。相反，HDAC4、5和7被敲除會(huì)損害重編程(圖2B)，另外兩個(gè)針對(duì)HDAC3的ShRNA也提高了重編程效率(圖2C)。此外，VPA沒(méi)有與HDAC3敲除協(xié)同促進(jìn)重編程(圖2C)，這表明PAN-HDAC抑制劑通過(guò)抑制HDAC3促進(jìn)OSKM重編程。

研究者使用一個(gè)脫乙酰酶零突變體HDAC3(HDAC3-YF）和一個(gè)雙突變體HDAC3 (HDAC3-YF-Ka)(圖2D)進(jìn)行了過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，選取HDAC1(HDAC1-YF)和HDAC2(HDAC2-YF)對(duì)照。過(guò)表達(dá)HDAC1-YF和HDAC2-YF適度促進(jìn)了OSKM重編程(圖2E)，而HDAC3-YF有效地增強(qiáng)了OSKM重編程(圖2F)，重要的是，HDAC3-YF-KA突變體中HDAC3-YF對(duì)重編程的促進(jìn)作用在HDAC3-YF-KA突變體中消失，表明HDAC3-YF需要與NCoR/SMRT相互作用，才能作為HDAC3的顯性負(fù)值(圖2D，E)。這些結(jié)果表明，HDAC3介導(dǎo)NCoR/SMRT對(duì)OSKM重編程的負(fù)效應(yīng)，這一功能需要脫乙酰酶活性，但抑制NCoR/SMRT和HDAC3對(duì)體細(xì)胞基因的影響并不相同。后者或許可以用以下事實(shí)來(lái)解釋?zhuān)耗繕?biāo)位點(diǎn)的NCoR/SMRT耗盡會(huì)抑制其他酶活性，也可能招募共同激活者。

圖2

3. 在重編程過(guò)程中，HDAC3誘導(dǎo)組蛋白在限制性基因組位點(diǎn)去乙?；?/span>

為了了解HDAC3是如何損害OSKM重編程的，研究者通過(guò)免疫印跡分析了MEF、ESC和OSKM重編程中間產(chǎn)物中組蛋白H3乙酰化(AcH3)和組蛋白H4乙?；?AcH4)的總水平。結(jié)果顯示，胚胎干細(xì)胞的AcH3和AcH4水平均高于MEF(圖3A)，且在VPA或TSA增強(qiáng)的OSKM重新編程中，AcH3和AcH4的水平均有增加(圖3A，B)。然而NCoR/SMRT的缺失或HDAC3-YF的過(guò)表達(dá)并沒(méi)有進(jìn)一步增加AcH3或AcH4的水平，且受NCoR/SMRT-HDAC3調(diào)控的兩個(gè)具有代表性的乙酰化組蛋白標(biāo)記H3K27ac和H4K12ac也出現(xiàn)了同樣的情況(圖3C，D)。CHIP-Seq實(shí)驗(yàn)表明，NCoR/SMRT-HDAC3復(fù)合體在特定的細(xì)胞環(huán)境中以總基因組的一小部分為靶標(biāo)。接下來(lái)，研究者測(cè)量了所有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的H3K27ac水平，結(jié)果表明HDAC3-YF過(guò)表達(dá)對(duì)OSKM重編程中H3K27ac水平的影響是直接的。這些結(jié)果表明，HDAC3可能作為NCoR/SMRT復(fù)合體的一部分，通過(guò)在包括多能位點(diǎn)在內(nèi)的限制性位點(diǎn)誘導(dǎo)組蛋白去乙?；瘉?lái)?yè)p害OSKM重編程。

圖3

4. NCoR/SMRT在重編程中對(duì)多能性位點(diǎn)的上下文特定招募

研究者對(duì)第9天OSKM重編程進(jìn)行了CHIP-Seq，以研究NCoR/SMRT是否被招募到多能位點(diǎn)，通過(guò)HDAC3誘導(dǎo)組蛋白去乙酰化。結(jié)果顯示，很大一部分NCoR/SMRT結(jié)合峰在重新編程(76%)和ESC(56%)中共享(圖4A，B)。GO分析表明，在第5組和第15組，尤其是第5組，NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)在干細(xì)胞相關(guān)術(shù)語(yǔ)中得到豐富，而在第7組中，NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)在分化相關(guān)術(shù)語(yǔ)中得到豐富(圖4C)。NCoR/SMRT僅在重編程期間才被招募到多能性基因座Sox2和Prdm4 ，這些基因座在重編程中顯示出比ESC中更低的H3K27ac水平(圖4D)。ChIP-qPCR技術(shù)證實(shí)了NCoR/SMRT在重編程時(shí)與Nanog和Utf1啟動(dòng)子結(jié)合，在ESC中的結(jié)合程度較小(圖4E)，而在MEF中幾乎沒(méi)有NCoR/SMRT結(jié)合。這些結(jié)果表明，NCoR/SMRT招募到多能位點(diǎn)會(huì)使重編程脫軌，而在ESC中，這些共抑制因子具有不同的功能，可能與發(fā)育過(guò)程中的組織規(guī)格有關(guān)。

圖4

研究者為模擬多能性狀態(tài)，探究HDAC3-YF過(guò)表達(dá)是否有助于增加NCoR/SMRT靶基因位點(diǎn)的H3K27ac水平，在重新編程的第5、9和13天測(cè)量了所有NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)的H3K27ac水平，并在重新編程的第9天測(cè)量了所有NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)的ESC水平。結(jié)果顯示，對(duì)于所有被NCoR/SMRT結(jié)合的位點(diǎn)，早期重新編程時(shí)間點(diǎn)的H3K27ac水平較低，尤其是在HDAC3-YF和ESCS中，在第13天升高（在第9天則降低）(圖5A)。在對(duì)NCoR / SMRT結(jié)合組5和15（圖5B，C）進(jìn)行重編程時(shí)測(cè)量H3K27ac水平以及在重編程中被NCoR / SMRT結(jié)合的“第二波”基因中檢測(cè)到了相似的結(jié)果(圖5D)。此外，為了研究HDAC3-YF對(duì)NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)H3K27ac水平的增強(qiáng)作用是否與基因表達(dá)增加有關(guān)，我們對(duì)NCoR/SMRT結(jié)合的一組多能性相關(guān)基因(包括許多“第二波”基因)在TSS的2kb范圍內(nèi)進(jìn)行了RT-qPCR。結(jié)果顯示NCoR/SMRT結(jié)合、重編程第13天H3K27ac水平升高(第9天較低)與HDAC3-YF過(guò)表達(dá)時(shí)基因表達(dá)增加之間有很好的相關(guān)性(圖5E)，在NCOR1/2基因敲除時(shí)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。相比之下，在重新編程的第9天，一組在ESC中的表達(dá)高于MEF的第二波基因，在TSS的20kb范圍內(nèi)沒(méi)有NCoR/SMRT結(jié)合，在HDAC3-YF的第9天或第13天，H3K27ac水平幾乎或沒(méi)有增加。然而，ESC中這些位點(diǎn)的H3K27ac水平明顯低于第5組和第15組(圖5B，C)。胚胎干細(xì)胞在某些發(fā)育基因上顯示出適度的H3K27ac水平，這使得它們能夠在分化過(guò)程中迅速激活。這些結(jié)果證實(shí)了NCoR/SMRT通過(guò)HDAC3介導(dǎo)組蛋白去乙酰化來(lái)抑制多能性基因的重新激活。

圖5

5. c-MYC在重新編程時(shí)招募了NCoR / SMRT–HDAC3復(fù)合體      

外源OSKM因子是將NCoR/SMRT-HDAC3募集到DNA的有力候選者。HEK293T細(xì)胞中的免疫共沉淀證實(shí)了OSK與NCoR / SMRT的相互作用，但與c-MYC的結(jié)合更強(qiáng)（圖6A）。值得注意的是，這種c-MYC-NCoR/SMRT間的相互作用需要NCoR和SMRT的氨基末端結(jié)構(gòu)域(圖6B，C)，這是行使抑制功能所必需的。在OSKM重編程的第9天，研究者用外源性c-MYC和內(nèi)源性HDAC3在血清+VC中免疫共沉淀NCoR和SMRT的N端(圖6D)，結(jié)果顯示，外源性c-MYC可以共沉淀內(nèi)源性HDAC3(圖6E)。ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，NCoR/SMRT中還存在著一個(gè)c-MYC結(jié)合基序(圖6F)。此外，NCOR1/2基因敲除未能提高OSK(圖6G)的重編程效率，HDAC3-YF的表達(dá)對(duì)OSK(圖6H)的重編程也沒(méi)有有利影響。

圖6

為研究NCoR/SMRT和c-MYC結(jié)合位點(diǎn)之間的全基因組相關(guān)性，研究者比較了NCoR/SMRT的結(jié)合與OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的結(jié)合情況(圖7A)。IPSC前體是穩(wěn)定的克隆細(xì)胞系，在OSKM重編程中經(jīng)常出現(xiàn)，它經(jīng)歷了重新編程的初始階段，但是未能激活多能網(wǎng)絡(luò)。在IPSC前體中，NCoR/SMRT與OSKM的重疊最強(qiáng)的是c-MYC，其次是KLF4和OCT4/SOX2(圖7B，C)。IPSC前體的NCoR / SMRT和KLF4之間的大部分重疊位點(diǎn)都被c-MYC結(jié)合(圖7D)，但是這些位點(diǎn)中的很大一部分在這三個(gè)重編程因素之間共享（圖7E-G）。因此，在四個(gè)山中因子中，c-MYC主要有助于將NCoR / SMRT募集到基因組位點(diǎn)（包括多能性位點(diǎn)），從而對(duì)重編程產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖7

6. 外源c-MYC在重編程中的雙重作用

為了進(jìn)一步評(píng)估c-MYC和NCoR/SMRT在重編程中抑制多潛能基因的關(guān)系，研究者構(gòu)建了由Oct4末端增強(qiáng)子(Oct4-DE)驅(qū)動(dòng)的DsRed慢病毒報(bào)告程序(圖8A)。該報(bào)告整合到基因組中，可以通過(guò)多能轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合直接激活，而無(wú)需進(jìn)行完全重編程。OCT4、SOX2或KLF4在MEF中的單獨(dú)過(guò)表達(dá)略微激活了報(bào)告因子，但它們的組合具有協(xié)同作用(圖8B，C)。相比之下，c-MYC單獨(dú)沒(méi)有激活作用，但與OSK結(jié)合使用會(huì)削弱報(bào)告基因活性的增加(圖8B，C)。研究者進(jìn)一步用OSK和多西環(huán)素誘導(dǎo)的c-MYC重新編程MEF(圖8D)。從第3-9天開(kāi)始誘導(dǎo)c-MYC導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)記堿性磷酸酶陽(yáng)性的菌落數(shù)量達(dá)到峰值，這在重新編程中相對(duì)較早出現(xiàn)，而如果在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中誘導(dǎo)了c-MYC，則這種增加不會(huì)進(jìn)一步改變（圖8E）。c-MYC誘導(dǎo)后第3天至第9天Oct4-GFP+集落數(shù)量也達(dá)到高峰，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，Oct4-GFP+集落數(shù)量明顯減少(圖8F)。這些結(jié)果都表明，VP16工程轉(zhuǎn)錄因子提高重編程效率的一個(gè)機(jī)制是通過(guò)抵消由OSKM，特別是c-MYC招募的NCoR/SMRT共抑制子對(duì)多能性位點(diǎn)的負(fù)面影響。

圖8

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