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中文標(biāo)題：P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信號軸調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞增殖

發(fā)表期刊：Nature Communications

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：17.694

發(fā)表時間：2019年

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。闡明CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制將有助于尋找新的診斷生物標(biāo)志物和開發(fā)有效的治療干預(yù)措施。在過去的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與結(jié)直腸癌形成和發(fā)展的蛋白質(zhì)編碼基因，然而，包括microRNA(MiRNA)在內(nèi)的非編碼RNA的功能在很大程度上仍需進(jìn)一步研究。

● 研究結(jié)果

1. miR-500a-5p在CRC中被下調(diào)

研究者通過陣列分析確定了人類正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞和人類結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和LoVo中的總體miR表達(dá)。在這些差異表達(dá)的miR中，有十七個miR在SW620和LoVo細(xì)胞中共享相似的表達(dá)模式（圖1A）。其中，miR-500a-5p引起了研究者的注意。研究者檢測了miR-500a-5p在9個細(xì)胞系中以及81對人類CRC組織和匹配的非腫瘤組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常人腸上皮FHC和NCM460細(xì)胞相比，SW480，DLD1，SW1116，SW620，HCT116，LoVo和Caco2細(xì)胞中的miR-500a-5p水平顯著降低。此外在64個CRC樣本中，miR-500a-5p的表達(dá)下調(diào)了7.67倍（圖1C）。與鄰近的正常結(jié)腸粘膜組織相比，其在CRC患者組織中的表達(dá)明顯降低（圖1D）。原位雜交（ISH）顯示它位于CRC細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（圖1E）。此外，研究者將患者按照低表達(dá)/高表達(dá)分組 ，Kaplan–Meier生存曲線分析結(jié)果表明，miR-500a-5p表達(dá)低的442例結(jié)腸癌患者的總體生存期較短。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CRC細(xì)胞中miR-500a5p的表達(dá)下調(diào)，且miR-500a-5p的低表達(dá)與CRC患者的不良生存率有關(guān)。

圖1

2. miR-500a-5p的表達(dá)減弱了CRC的惡性進(jìn)展

為確定miR500a-5p表達(dá)的臨床相關(guān)性，研究者首先評估了CRC的臨床病理特征，結(jié)果顯示miR-500a5p的低表達(dá)與CRC的惡性進(jìn)展有關(guān)。為探討miR-500A-5P在CRC發(fā)展中的作用，研究者分別用miR-500a-5p模擬物和miR500a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染極低水平miR500a-5p的CRC細(xì)胞和正常人的結(jié)腸上皮細(xì)胞?？寺⌒纬蓪嶒灪虴DU實驗結(jié)果表明，miR-500A-5p在CRC細(xì)胞中的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制（圖1F-I）。FACS分析、傷口愈合和跨孔侵襲實驗也進(jìn)一步表明，miR-500A-5P對CRC細(xì)胞的惡性特性有抑制作用。

圖2

3. HDAC2是miR-500A-5P的一個功能性靶標(biāo)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，在微陣列和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)之間有66個基因重疊(圖2A)。其中，含有HDAC2基因的60個基因在miR-500A-5P過表達(dá)細(xì)胞中與對照細(xì)胞相比顯著下調(diào)(圖2B)。研究者通過WB和miRNA分析研究了潛在靶基因HDAC2與miR-500A-5p表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示與相應(yīng)的非癌對照組相比，癌組織的HDAC2蛋白表達(dá)水平較高，而miR-500A-5p的表達(dá)水平較低(圖2C，D)。此外，81例患者的CRC標(biāo)本中HDAC2的mRNA水平與miR500a-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖2E)。熒光素酶報告分析實驗結(jié)果表明，miR-500A-5p與miR-500A-5p模擬物共轉(zhuǎn)染HDAC2-WT3?-UTR后，熒光素酶活性降低。這兩個位點中的任何一個突變都取消了miR-500A-5P對熒光素酶活性的抑制作用(圖3A，B)，進(jìn)一步證實了HDAC2是miR500a-5p的靶基因。WB分析轉(zhuǎn)染miR-500A-5p模擬物或抑制劑的結(jié)腸上皮細(xì)胞中HDAC2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，與m-NC細(xì)胞相比，該蛋白在轉(zhuǎn)染miR-500a-5p模擬物的CRC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC和NCM460中表達(dá)上調(diào)(圖3C)?？寺⌒纬?、WST-1和Transwell實驗表明，HDAC2的過表達(dá)可以部分消除miR-500a-5p對細(xì)胞的抑制作用(圖3D-F)。這些結(jié)果表明，miR-500A-5p通過下調(diào)HDAC2的表達(dá)來抑制CRC的發(fā)生和發(fā)展。

圖3

4. miR-500A-5P通過靶向HDAC2在體內(nèi)抑制CRC細(xì)胞的生長

為了評價miR-500A-5p對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響，研究者進(jìn)行了小鼠異種移植模型實驗(圖4A)。結(jié)果顯示，注射LoVo/miR-500A-5p細(xì)胞的小鼠的腫瘤比注射LoVo/m-NC細(xì)胞的小。此外，注射LoVo/HDAC2細(xì)胞的小鼠比注射LoVo/Vector和LoVo/miR-500A-5p細(xì)胞的小鼠形成了更大的腫瘤，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2細(xì)胞形成的異種移植瘤比LoVo/HDAC2細(xì)胞小(圖4A，B)。接下來，研究者檢測了五組移植瘤中細(xì)胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)。IHC染色分析結(jié)果顯示，與LoVo/m-NC組相比，LoVo/miR-500A-5p組的增殖率和腫瘤血管密度顯著降低(圖4C-F）。此外，LoVo/HDAC2組與LoVo/Vector組和LoVo/miR-500a5p細(xì)胞組相比生長迅速，腫瘤血管密度增加，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2組抑制了LoVo/HDAC2組的生長速度和腫瘤血管密度(圖4D，F(xiàn))，而LoVo/miR-500A-5p/HDAC2組的生長速度和腫瘤血管密度均低于LoVo/Vector組和LoVo/miR-500a5p細(xì)胞組(圖4D，F(xiàn))。這些數(shù)據(jù)證實了miR-500A-5P下調(diào)了HDAC2介導(dǎo)的小鼠CRC細(xì)胞的生長。

圖4

5. MIR-500A-5P受轉(zhuǎn)錄因子YY1負(fù)調(diào)控

研究者分析了miR-500A-5P基因上游1kb的基因組DNA序列。本實驗表明，miR-500A-5p啟動子(p-Luc-1kb)能夠驅(qū)動熒光素酶的表達(dá)。因此，miR-500A-5P的表達(dá)是由其自身的啟動子驅(qū)動的。一些研究表明轉(zhuǎn)錄因子YY1與HDAC相互作用，因此研究者研究了轉(zhuǎn)錄因子YY1是否能調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中miR-500A-5p的表達(dá)。CONSITE軟件分析結(jié)果顯示，YY1的三個最可能的結(jié)合基序位于?327至?333、?622至?628和?741至?747區(qū)域(圖5A，B)。雙熒光素酶試驗表明，YY1細(xì)胞中miR-500A-5p位點1、2和3的活性比載體細(xì)胞降低2.5倍以上(圖5C)。為了證實YY1在體內(nèi)能夠與miR-500A-5P啟動子物理結(jié)合，研究者在表達(dá)外源YY1的CRC細(xì)胞中進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測。用抗YY1抗體進(jìn)行免疫沉淀后，3個YY1結(jié)合位點的miR-500A-5p啟動子區(qū)域均有明顯的富集(圖5D)。

研究者進(jìn)一步分析了YY1和miR-500A-5p在10例新鮮收集的CRC活檢組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與相應(yīng)的非癌對照相比，癌癥組織顯示出更高的YY1蛋白表達(dá)，而miR-500A-5p的表達(dá)則降低(圖5E)。YY1mRNA表達(dá)與miR-500A-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖5F)。此外，YY1的瞬時表達(dá)不僅導(dǎo)致了miR-500A-5p的成熟形式，也導(dǎo)致了miR-500A-5p的前體或初級轉(zhuǎn)錄本在LoVo和SW620細(xì)胞中的表達(dá)減少(圖5G)。研究者還評估了HDAC2或YY1的表達(dá)與相同臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，HDAC2和YY1的表達(dá)與CRC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。最后，采用免疫組織化學(xué)(IHC)或原位雜交(ISH)方法檢測基因表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-500A-5p在CRC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，免疫組化顯示CRC組織中HDAC2和YY1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。miR-500A-5p的表達(dá)與HDAC2或YY1呈負(fù)相關(guān)（圖5H）。這些結(jié)果表明，YY1下調(diào)了CRC細(xì)胞miR500a-5p的表達(dá)水平，從而影響了YY1-miR500a-5p-HDAC2通路的功能。 

圖5

6. 在CRC細(xì)胞中，miR-500A-5p表達(dá)的恢復(fù)是通過YY1/p300/HDAC2復(fù)合體上調(diào)的

研究者將HA標(biāo)記的p300轉(zhuǎn)染到CRC細(xì)胞中，檢測p300蛋白是否與HDAC2或YY1相互作用。結(jié)果表明，抗HA(P300)抗體可以從細(xì)胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(圖6A)。同樣，HA(P300)或YY1用抗HDAC2抗體進(jìn)行免疫共沉淀(圖6B)。為進(jìn)一步證實HDAC2-p300-YY1復(fù)合體的形成，研究者使用內(nèi)源蛋白進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。抗p300抗體可以從CRC細(xì)胞提取物中共沉淀HDAC2和YY1(圖6C)。類似地，p300和YY1都被抗HDAC2抗體(圖6D)免疫共沉淀，這表明這三種蛋白很可能在體內(nèi)以復(fù)合物的形式存在。為了探討miR-500A-5P分子與YY1/p300/HDAC2復(fù)合體的關(guān)系，分別將載體YY1、HDAC2和p300的表達(dá)質(zhì)粒與YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300聯(lián)合轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞，結(jié)果表明，p300過表達(dá)促進(jìn)miR-500a5p的表達(dá)，而YY1或HDAC2則抑制miR-500a5p的表達(dá)。此外，p300與HDAC2和/或YY1協(xié)同作用可抑制CRC細(xì)胞miR-500A-5p的表達(dá)(圖6E)，表明YY1或HDAC2與p300有拮抗作用，從而抑制miR-500A-5p的表達(dá)。

接下來，研究者將YY1、HDAC2和p300表達(dá)質(zhì)粒分別單獨或與YY1+p300、HDAC2+p300和YY1+HDAC2+p300共轉(zhuǎn)染到報告基因質(zhì)粒pGL3-miR-500A-5p上，結(jié)果表明YY1和HDAC2單獨表達(dá)對miR-500A-5p有明顯的抑制作用，而p300的異位表達(dá)則刺激miR-500a-5p的表達(dá)。當(dāng)HDAC2+p300、YY1+p300或HDAC2+p300+YY1共轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)與p300共轉(zhuǎn)染可減緩對HDAC2或/和YY1的miR-500a5p轉(zhuǎn)錄活性的降低(圖6F)。ChIP實驗證明了YY1與miR-500A-5p啟動子區(qū)域的結(jié)合與LoVo和SW620細(xì)胞中三個YY1結(jié)合位點的HDAC2和p300相關(guān)。過表達(dá)/敲除實驗表明，YY1的過表達(dá)增加了YY1與miR-500A-5P位點1、2和3近端啟動子的結(jié)合。此外，在CRC細(xì)胞中，p300的瞬時轉(zhuǎn)染減少，而HDAC2的過表達(dá)增加，YY1與miR-500A-5p啟動子的結(jié)合(圖6G)。相反，YY1基因敲除降低了YY1與miR-500A-5p啟動子的結(jié)合。這些結(jié)果表明，在CRC細(xì)胞中miR-500a5p的過表達(dá)是通過YY1/p300/HDAC2復(fù)合體上調(diào)的。

圖6

7. 治療性傳遞miR-500A-5P能夠抑制異種移植瘤和FK228治療的CRC腫瘤發(fā)展

細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，miR-500A-5P比對照組更能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。為探討miR-500A-5p在細(xì)胞對HDAC抑制劑FK228介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性中的作用，研究者用FK228處理細(xì)胞，流式細(xì)胞分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-500A-5p+FK228的細(xì)胞凋亡率明顯高于miR-500A-5p(圖7A)。這些結(jié)果表明miR-500A-5P在體外可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對FK228誘導(dǎo)的凋亡誘因的敏感性。為了探討miR-500A-5P對CRC的治療潛力，研究者建立了異種移植小鼠模型和FK228處理的CRC模型。結(jié)果顯示，注射LoVo細(xì)胞39天后，miR-500A-5P和miR-500A-5P+FK228組小鼠的腫瘤體積明顯小于MNC組（圖7C，D）。TUNEL染色顯示，聯(lián)合注射miR-500A-5P和FK228的腫瘤細(xì)胞凋亡率最高(圖7E)。這些發(fā)現(xiàn)提示miR500a-5p增強(qiáng)了癌細(xì)胞對HDAC抑制劑FK228誘導(dǎo)的凋亡觸發(fā)器的敏感性。以上結(jié)果表明，miR-500A-5P具有腫瘤抑制作用，具有治療CRC的潛力。

圖7

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