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中文標(biāo)題：Flot2是蛋白尿腎病中足細(xì)胞損傷的新調(diào)控因子

發(fā)表期刊：International Journal of Biological Sciences

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：10.750

發(fā)表時間：2023年1月

合作單位：廣東省人民醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：GST pull down MS（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

足細(xì)胞損傷是慢性腎臟疾病(CKD)的常見標(biāo)志。足細(xì)胞指狀足突相互交織形成狹縫隔膜(SD)，是腎小球?yàn)V過屏障最重要的組成部分。這一過濾屏障的完整性對于防止蛋白質(zhì)進(jìn)入尿液(蛋白尿)非常重要。越來越多的致病SD蛋白已被發(fā)現(xiàn)，包括nephrin、podocin和CD2AP等。

本研究證實(shí)Flotillin-2（Flot2）在足細(xì)胞中特異性表達(dá)，對募集SD蛋白podocin和nephrin進(jìn)入脂筏、改善足細(xì)胞損傷有至關(guān)重要的作用。Flot2和podocin通過SPFH結(jié)構(gòu)域直接相互作用，此外轉(zhuǎn)錄因子KLF15可以調(diào)控Flot2的表達(dá)。在LPS/ADR誘導(dǎo)腎病小鼠模型中，足細(xì)胞特異性Flot2的缺失會加重蛋白尿、足細(xì)胞損傷和腎小球病變。此外，足細(xì)胞病變患者的腎活檢中Flot2表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與蛋白尿負(fù)相關(guān)，與eGFR正相關(guān)，表明Flot2可能是蛋白尿腎病的新治療靶點(diǎn)。

● 研究結(jié)果

1. Flot2在體內(nèi)外受損足細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

Flot2是一種廣泛表達(dá)且高度保守的疏水性脂筏蛋白。研究者對蛋白尿腎小球疾病患者的腎活檢樣本進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)Fot2在患者足細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下降（圖1A）。在糖尿病db/db小鼠（圖1B），脂多糖（LPS）或阿霉素（ADR）誘導(dǎo)的腎病小鼠（圖1C）中，腎臟中Flot2的表達(dá)也降低。在體外，高糖（HG）或LPS能顯著降低足細(xì)胞Flot2的表達(dá)（圖1D-F）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)lot2在體內(nèi)和體外損傷的足細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

  圖1

2. 足細(xì)胞特異性Flot2的缺失加重了LPS和ADR誘導(dǎo)的腎病小鼠的蛋白尿和腎損傷

研究者首先利用Cre-LoxP重組系統(tǒng)建立了足細(xì)胞特異性flot2敲除小鼠（圖2A-E），之后用LPS和ADR誘導(dǎo)建立蛋白尿小鼠模型，進(jìn)而評估了Flot2表達(dá)減少對蛋白尿和腎損傷的影響（圖2F）。LPS注射后24h，小鼠尿蛋白水平升高，其中flot2敲除小鼠的尿蛋白水平顯著高于未敲除組（圖3A）。同樣，ADR注射后約2周時，小鼠尿蛋白開始隨時間延長而逐漸增加，并且flot2敲除小鼠的增加更多（圖3B），PAS染色顯示系膜擴(kuò)張也增加更多（圖3C-D）。透射電鏡顯示，用LPS或ADR處理的Flot2敲除小鼠的足細(xì)胞足突消失更多，足突寬度顯著增加（圖3E-F）。這些結(jié)果表明，敲除Flot2的足細(xì)胞增加了對LPS和ADR的易感性和腎損傷。

圖2

圖3

3. 足細(xì)胞特異性Flot2過表達(dá)改善LPS和ADR誘導(dǎo)的小鼠蛋白尿和腎損傷

接著，研究者又構(gòu)建了足細(xì)胞特異性flot2過表達(dá)C57BL/6小鼠，并通過腹腔注射LPS或尾靜脈注射ADR建立足細(xì)胞損傷和蛋白尿小鼠模型，研究了Flot2在體內(nèi)對足細(xì)胞的保護(hù)作用（圖4）。LPS注射24h后或ADR注射4-12周，flot2過表達(dá)組小鼠的尿蛋白增加量顯著少于對照組（圖5A-B）。此外，ADR處理的flot2過表達(dá)組小鼠的系膜基質(zhì)擴(kuò)張減弱（圖5C-D）。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)LPS處理導(dǎo)致小鼠足細(xì)胞足突融合，F(xiàn)lot2過表達(dá)改善了這種變化（圖5E-F）；注射ADR12周后，F(xiàn)lot2過表達(dá)小鼠的足突消失和足突寬度相比對照組明顯改善（圖5E-F）。這些數(shù)據(jù)表明足細(xì)胞特異性Flot2的過表達(dá)對LPS和ADR誘導(dǎo)的損傷有保護(hù)作用。

圖4

圖5

4. 體外實(shí)驗(yàn)表明足細(xì)胞Flot2調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架的排列

由于細(xì)胞骨架重組在足細(xì)胞損傷和蛋白尿中起著重要作用，因此研究者使用體外足細(xì)胞模型探討了Flot2對足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。Flot2敲低導(dǎo)致肌動蛋白絲重組和細(xì)胞質(zhì)徑向應(yīng)力纖維溶解(圖6A-D)，并刺激細(xì)胞收縮，使細(xì)胞變小。在腺病毒介導(dǎo)的Flot2過表達(dá)足細(xì)胞中（圖6E-G），肌動蛋白重排和細(xì)胞收縮被消除（圖6H），說明Flot2導(dǎo)致足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排。

圖6

5. 脂筏中SD蛋白的定位需要Flot2

SD蛋白調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架動力學(xué)、蛋白表達(dá)和細(xì)胞存活，因此研究者通過干擾和過表達(dá)足細(xì)胞中的Flot2來觀察SD蛋白在脂筏中的定位。結(jié)果顯示，干擾Flot2顯著降低了SD蛋白podocin和nephrin在脂筏中的質(zhì)膜分布（圖7A），在LPS處理的足細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果。相反，過表達(dá)Flot2促進(jìn)了podocin和nephrin在脂筏中的表達(dá)（圖7B）。之后，CTxB標(biāo)記也觀察到Flot2干擾降低了podocin在脂筏中的分布，LPS和ADR處理的足細(xì)胞有類似結(jié)果（圖7C），過表達(dá)Flot2恢復(fù)了脂筏中podocin的表達(dá)（圖7D）。接著，他們研究了足細(xì)胞特異性Flot2缺失小鼠在LPS處理下的podocin和nephrin分布，發(fā)現(xiàn)Flot2缺失導(dǎo)致LPS處理后小鼠脂筏中podocin和nephrin的減少加?。▓D7E）。體外結(jié)果表明Flot2可能有助于SD蛋白定位到脂筏中。

圖7

6. Flot2通過SPFH結(jié)構(gòu)域直接與足蛋白相互作用

通過雙標(biāo)記免疫熒光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，podocin和Flot2在人類和C57BL小鼠足細(xì)胞中有部分重疊（圖8A-B）。使用免疫沉淀（Co-IP）檢測到它們在足細(xì)胞中有相互作用（圖8C），通過GST-pull down和His-pull down檢測確定了Flot2和podocin之間有直接相互作用（圖8D）。之后，研究者構(gòu)建了5個截短的Flot2載體和6個截短的podocin載體（圖8E-F），足細(xì)胞CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了Flot2的30-184氨基酸與podocin相互作用（圖8G），F(xiàn)lot2與podocin的128-284氨基酸相互作用（圖8H）。HEK-293T細(xì)胞的免疫共沉淀和GST pull down實(shí)驗(yàn)也確定了Flot2蛋白的氨基酸30-184與podocin蛋白的128-284氨基酸具有相互作用（圖8I-J）。

圖8

7. 轉(zhuǎn)錄因子KLF15介導(dǎo)了Flot2的轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析顯示，Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子（KLFs）可能參與了對Flot2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。以往研究顯示KLF4、KLF6和KLF15在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)，且在蛋白尿腎小球疾病的受損足細(xì)胞中表達(dá)較低。因此，本研究首先在HG、LPS或ADR誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中確定了它們的表達(dá)水平，結(jié)果與之前研究一致（圖9A）。此外，當(dāng)干擾KLF6或KLF15后，足細(xì)胞中的Flot2 mRNA顯著降低（圖9B-D），干擾KLF15后Flot2蛋白表達(dá)也顯著降低（圖9E-F）。足細(xì)胞KLF15過表達(dá)后，F(xiàn)lot2的mRNA和蛋白水平顯著增加（圖9G-I），表明KLF15是Flot2表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。ChIP-qPCR結(jié)果表明KLF15與Flot2啟動子結(jié)合（圖9J），并且LPS處理后，小鼠足細(xì)胞中KLF15與Flot2啟動子的結(jié)合顯著減少（圖9K）。雙熒光素酶報(bào)告基因測定發(fā)現(xiàn)，干擾KLF15導(dǎo)致Flot2轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，而過表達(dá)KLF15則升高（圖9L），表明KLF15直接調(diào)節(jié)Flot2基因啟動子活性。

圖9

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