中文標題：LncRNA FOXD3-AS1通過募集H3K27Ac促進 YBX1轉錄和鼻咽癌發(fā)展

發(fā)表期刊：Frontiers in Oncology

影響因子：5.738

發(fā)表時間：2021年7月

合作單位：中南大學湘雅三醫(yī)院腫瘤科

運用技術：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、LC-MS/MS質譜檢測（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

長鏈非編碼RNA（lncRNA）可影響各種腫瘤的進展，包括鼻咽癌（NPC）。已有報道lncRNA FOXD3-AS1影響多種癌癥的進展，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在NPC組織中高度表達，并與NPC的惡性進展有關，但FOXD3-AS1影響NPC惡性進展的機制仍有待進一步探索。

● 研究結果

1、LncRNA FOXD3-AS1在鼻咽癌組織和細胞系中過表達

首先，研究者通過GSE數(shù)據(jù)集查找發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3-AS1在NPC組織中的表達水平顯著高于正常鼻咽組織（圖1A、B）。其次，TCGA公共數(shù)據(jù)庫也顯示FOXD3-AS1在頭頸部鱗狀細胞癌和NPC組織中都有高表達（圖1C、D）。RT-qPCR檢測六種鼻咽癌細胞系（HNE1、HK1、HONE1、CNE1、CNE2和SUNE1，圖1E）和正常鼻咽上皮細胞系（NP69，圖1E），也發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在NPC細胞系中表達顯著上調（圖1E）。LNCipedia數(shù)據(jù)庫分析（圖1F）和二級結構預測（圖1G）證實FOXD3-AS1沒有編碼蛋白質的能力。

圖1

2、LncRNA FOXD3-AS1體外促進鼻咽癌惡性進展

為了闡明FOXD3-AS1在NPC細胞系中的作用，在SUNE1和HONE1細胞中轉染sh RNA質粒（shF1和shF2）敲低FOXD3-AS1的表達（圖2A）。CCK-8測定和克隆形成實驗結果表明FOXD3-AS1敲低導致NPC細胞增殖減少（圖2B、C），Transwell結果顯示敲低FOXD3-AS1導致NPC細胞遷移能力（圖2D）和侵襲能力減弱（表2E）。

圖2

3、LncRNA FOXD3-AS1特異性靶向YBX1并調控YBX1的表達

通過核質分離和FISH實驗確定了FOXD3-AS1同時存在于NPC細胞的細胞核和細胞質中，但在細胞核里面的含量更高（圖3A、B）。為了找到FOXD3-AS1的靶蛋白，研究者進行了RNA pull-down（圖3C）和質譜(MS)分析鑒定（圖3D），鑒定到潛在結合蛋白YBX1，RNA pulldown WB技術實驗驗證了FOXD3-AS1可以與YBX1結合（圖E）。RNA免疫沉淀（RIP）qPCR實驗操作再次確認了YBX1是FOXD3-AS1的靶蛋白（圖F）。為了探討FOXD3-AS1和YBX1的表達關系，在體外NPC細胞系中敲低FOXD3-AS1的表達后，發(fā)現(xiàn)YBX1的轉錄和翻譯水平受到抑制（圖3G，H）。當FOXD3-AS1過表達時，YBX1的轉錄和翻譯水平也跟著上調（圖3I，J）。

圖3

4、LncRNA FOXD3-AS1通過募集H3K27ac調節(jié)YBX1的表達

為什么lncRNA FOXD3-AS1能調控YBX1的表達呢？生信分析發(fā)現(xiàn)YBX1的啟動子可以結合H3K27ac（圖4A）。為了驗證這一點，研究者進行了H3K27ac的染色質免疫沉淀（ChIP）分析，YBX1啟動子區(qū)qPCR產(chǎn)物的凝膠電泳結果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1敲低顯著降低了YBX1啟動子區(qū)的H3K27ac富集（圖4B）。野生型和突變型YBX1的雙熒光素酶實驗結果表明，敲低FOXD3-AS1抑制了H3K27ac在YBX1啟動子區(qū)的富集（圖4D）。使用組蛋白乙酰轉移酶的抑制劑C646阻斷H3K27的乙?；?，發(fā)現(xiàn)YBX1的表達降低，表明H3K27ac會影響YBX1的表達（圖4C）。這些實驗結果表明FOXD3-AS1可以通過募集H3K27ac來調節(jié)YBX1的表達。

圖4

5、YBX1可逆轉lncRNA FOXD3-AS1敲低誘導的增殖、遷移和侵襲

為了研究FOXD3-AS1是否通過靶向YBX1促進腫瘤進展，在敲低FOXD3-AS的細胞中轉染YBX1過表達質粒（圖5A），經(jīng)CCK8檢測（圖5B），克隆形成實驗（圖5C）和Transwell實驗（圖5D、E）發(fā)現(xiàn)，YBX1可以逆轉FOXD3-AS1敲低對腫瘤的抑制作用。

圖5

6、LncRNA FOXD3-AS1在體內(nèi)促進NPC惡性進展

為了證實lncRNA FOXD3-AS1在NPC惡性進展中的作用，研究者將FOXD3-AS1敲低的NPC細胞和對照細胞注射到小鼠體內(nèi)構建了腫瘤生長轉移模型，結果顯示FOXD3-AS1敲低組的移植瘤較?。▓D6A、B），重量較輕（圖6C）且肺轉移較少（圖6D-F）。原位雜交結果顯示FOXD3-AS1敲低組腫瘤組織中的FOXD3-AS1表達降低了（圖6G，左）。免疫組化結果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1敲低組腫瘤組織中的YBX1表達也降低了（圖6G,右）。

圖6

輝駿生物實驗外包服務商，10年專注科研實驗，專業(yè)提供全方位蛋白質組學、蛋白/核酸互作、代謝組學、分子/細胞生物學、lncRNA專題實驗等科研服務。輝駿自有蛋白質檢測平臺，對RNA pull down產(chǎn)物等微量蛋白的質譜鑒定有充足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解。

目前，我們已為上千位客戶在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章（點擊查看客戶文獻），歡迎各位咨詢RNA pulldown MS檢測實驗，服務電話：4006991663！

RNA pull down技術實驗—輝駿服務內(nèi)容

RNA pull down實驗外包樣本要求

▲注意：以上均為每組樣本的送樣量，如果實驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細送樣指南可聯(lián)系輝駿生物索取。

保存及運輸：-80℃保存，干冰取樣/運輸，至少在送樣前2天通知我司。

輝駿生物客戶高質量RNA PullDown實驗文章