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中文標題：Circ-FBXW7在抑制膠質瘤發(fā)生中的新作用

發(fā)表期刊：JNCI J Natl Cancer Inst

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：11.816

發(fā)表時間：2018年3月

合作單位：中山大學第一附屬醫(yī)院

運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看詳情）

● 研究背景

環(huán)狀RNA(CircRNA)是廣泛存在于真核生物基因組中的RNA轉錄本。據(jù)報道，CircRNA在組織發(fā)育、基因調控和癌癥發(fā)生中都起著重要作用，是近來的一大研究熱點。然而，對于CircRNA是否編碼功能蛋白還有待進一步探究。

● 研究結果

1. CircRNA在人腦膠質母細胞瘤及癌旁正常組織中的不同表達模式

為了建立CircRNA圖譜數(shù)據(jù)庫，研究者對來自臨床膠質母細胞瘤組織及其配對的正常組織的核糖體RNA缺失的總RNA進行了RNA-seq分析，共鑒定出31145個CircRNA(圖1A)，使用RefSeq數(shù)據(jù)庫進行注釋，這些CircRNA大多來自蛋白質編碼的外顯子，其他的與內含子、5’-UTR、3’-UTR或反義序列比對(圖1B)。這些已鑒定的CircRNA大多數(shù)小于1500個核苷酸(圖1C)，且在癌組和正常組的染色體分布無明顯差異，而癌組中的CircRNA總表達下調(圖1D，E)。癌組和腫瘤組具有不同的CircRNA表達模式(圖1F）。研究者將癌癥組和正常組之間差異最大的候選基因與circRNADb進行匹配，在這些特定的候選基因中，由FBXW7基因外顯子3和外顯子4環(huán)化而成的新基因Circ_022705引起了研究者的注意(圖2A)。

圖1

2. 環(huán)狀RNA Circ-FBXW7的鑒定

為了驗證FBXW7基因的外顯子3和4是否形成了內源性CircRNA，研究者設計了聚合和發(fā)散引物，專門擴增FBXW7的規(guī)范形式或后剪接形式(圖2B)。Circ-FBXW7基因不能被RNase-R酶切，這些不同的引物不能在基因組DNA中擴增出任何產物，表明這一結果不是由于PCR產物或基因組重排造成的。研究者用跨越結引物驗證了RNA-Seq數(shù)據(jù)，qPCR檢測了100例膠質瘤標本和100例正常腦組織中Circ-FBXW7的表達。在膠質瘤中，F(xiàn)BXW7的表達低于正常腦組織(圖2C)。桑格測序發(fā)現(xiàn)，反向剪接形成了620nt的Circ-FBXW7，推測可能是由于內含子序列的剪切所致。在Northern blotting中，使用連接特異性探針進一步檢測到內源CircFBXW7(圖2E)。為了證明Circ-FBXW7的細胞定位，研究者進行了FISH分析，結果顯示胞漿中有豐富的Circ-FBXW7表達。當轉染SiRNA時，Circ-FBXW7的表達被抑制(圖2F)。對不同細胞組分的qPCR分析也進一步證實，Circ-FBXW7主要定位于細胞質中(圖2F)。

圖2

3. Circ-FBXW7編碼能力的評估

研究者分析了Circ-FBXW7的開放閱讀框(ORF)，發(fā)現(xiàn)在Circ-FBXW7中有一個潛在的跨越連接ORF，編碼185個氨基酸的蛋白質(圖3A)。為了測試Circ-FBXW7中可能的IRES活性，研究者使用雙酶載體系統(tǒng)在Rluc和Luc報告基因之間克隆了全長或截短的FBXW7 IRES序列。熒光素酶分析表明，與截短或突變的IRES相比，全長Circ-FBXW7 IRES誘導的LUC/Rluc活性最高，相反，空載體不能誘導LUC激活(圖3B)。這些結果表明，Circ-FBXW7 IRES可以誘導50個上限的獨立翻譯。接下來，研究者建立了一組載體來證實Circ-FBXW7在人類細胞中是可翻譯的。結果顯示，F(xiàn)LAG標簽抗體在Circ-FBXW7-FLAG和FBXW7-FLAG轉基因細胞中僅檢測到約22 kDa的蛋白，表明Circ-FBXW7-FLAG載體已被翻譯（圖3C）。接下來，研究者用液相色譜串聯(lián)質譜在Circ-FBXW7-293T細胞中分析了FBXW7-185aa的氨基酸序列。由于FBXW7185aa是由“跨越連接ORF”形成的，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)的獨特氨基酸進一步表明這個新的蛋白質是由Circ-FBXW7編碼的(圖3C，D)。

圖3

4. FBXW7-185aa對膠質瘤細胞的作用及其分子機制

為了排除Circ-FBXW7而不是FBXW7-185aa誘導生物學功能的可能性，研究者使用圖3C中描述的線性FBXW7-FLAG載體建立了穩(wěn)定高表達U251和U373的FBXW7-185aa細胞。通過使用Circ-FBXW7連接引物，我們發(fā)現(xiàn)Circ-FBXW7和Circ-FBXW7-IRES兩個mut載體都成功地過表達(圖4A)。此外，只有Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG載體的過表達才能上調FBXW7-185aa的表達(圖4B)。接下來，研究者檢測了這些細胞的細胞周期和細胞增殖率。Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG穩(wěn)定過表達的U251和U373細胞與對照細胞相比，表現(xiàn)出大量的G1期阻滯(圖4C)，存活率也大大降低降低(圖4D，E)。用特異性shRNA敲除Circ-FBXW7可降低FBXW7-185aa的表達(圖4F)，并加速細胞周期，提高細胞存活率(圖4G-I)。這些結果表明，F(xiàn)BXW7-185aa（而不是Circ-FBXW7）能夠誘導膠質瘤細胞周期停滯，抑制細胞增殖。

圖4

FBXW7α是FBXW7基因中含量最豐富的亞型，是一種定義明確的E3連接酶，可以針對c-Myc進行泛素化誘導的降解。研究者發(fā)現(xiàn)在Circ-FBXW7-和FBXW7-185aa過表達的細胞中c-Myc的表達都降低(圖5A)。鑒于上述證據(jù)，研究者推測FBXW7-185aa可能也有助于c-Myc蛋白的穩(wěn)定。半衰期試驗證實，與陰性對照相比，F(xiàn)BXW7-185aa對c-Myc具有去穩(wěn)定化作用。此外，F(xiàn)BXW7-185aa比FBXW7α更穩(wěn)定(圖5B)。據(jù)報道，去泛素化酶USP28通過與FBXW7αN端的相互作用與c-Myc結合，從而穩(wěn)定c-Myc。研究者推測FBXW7185aa可能通過USP28破壞c-Myc的穩(wěn)定性，Pull-down實驗和CoIP實驗表明，F(xiàn)BXW7-185aa在體外和體內與USP28相互作用(圖5C，D)。與FBXW7α相比，F(xiàn)BXW7-185aa與USP28具有更高的結合親和力，增加FBXW7-185aa可以競爭性地將FBXW7α從癌細胞中的USP28中釋放出來(圖5E)。體內和體外泛素化實驗表明，F(xiàn)BXW7185aa過表達可拮抗USP28誘導的c-Myc去泛素化，增加c-Myc泛素化。然而，僅憑FBXW7-185aa并不能泛化c-Myc(圖5F)。在Hs683和SW1783細胞中，F(xiàn)BXW7-185aa的過表達不能抑制c-Myc的表達，表明FBXW7-185aa通過FBXW7a調節(jié)c-Myc。此外，過表達USP28抑制了FBXW7-185aa誘導的c-Myc翻轉(圖5G)。以上證據(jù)共同闡明了FBXW7-185aa與USP28競爭性相互作用并“釋放”FBXW7α降解c-Myc。

圖5

5. Circ-FBXW7和FBXW-185aa的臨床意義

為了探索FBXW7-185aa潛在的臨床意義，研究者檢測了FBXW7-185aa在幾個已建立的膠質瘤細胞系中的表達。NHA和293T細胞FBXW7-185aa表達較強；SW1783和Hs683Ⅲ級膠質瘤細胞中FBXW7-185aa表達降低；膠質母細胞瘤細胞系U251和U373中FBXW7-185aa的表達水平最低。與腫瘤旁組織相比，在隨機選擇的6個膠質母細胞瘤患者樣本中FBXW7-185aa和Circ-FBXW7的表達相對降低(圖6A)。接下來，研究者檢測了38對來源于膠質母細胞瘤患者的癌組織和癌旁組織中Circ-FBXW7的表達，結果顯示在膠質母細胞瘤組織中，F(xiàn)BXW7的表達低于癌旁組織，同時Circ-FBXW7高表達的膠質母細胞瘤患者比低表達Circ-FBXW7的患者總生存期更長(圖6B)。由于常見的FBXW7α突變不影響Circ-FBXW7或FBXW7-185aa，研究者推測Circ-FBXW7和FBXW7-185aa是膠質母細胞瘤的獨立預后標記物。Circ-FBXW7穩(wěn)定過表達的U251和U373細胞顯示出比對照細胞低得多的致瘤性(圖6C)，此外，穩(wěn)定過表達U251和U373細胞的Circ-FBXW7小鼠比對照組的壽命更長(圖6D)。

圖6

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